香豆素类化合物检测方法及应用研究

论文摘要

香豆素类化合物具有广泛的药物治疗作用,在医学临床上,能发挥抗凝血、抗菌、镇静等多种药效作用。在中药领域,其又是多种中药中被公认的药效活性成分,并作为含量测定的指标成分被收载于2005版《中国药典》中。因此香豆素长期被用于战胜疾病,保障人民健康,提高社会生活质量。但是,近年来由于国内对香豆素类成分药效的夸大,以及人民群众对天然药物“安全无毒”宣传的错误理解,再加上不法经营者的黑心滥用。造成社会上大量因为使用和食用含有香豆素类成分的消费品而影响人民健康的恶性事件。因此香豆素的不良反应引起了社会的广泛关注。严格控制香豆素类成分滥用现象,减少香豆素类成分造成的不良反应,成为了保证人民健康的急需解决的问题。因为香豆素成分较为普遍存在,而且香豆素类成分的摄入途径很多,因此限制有害香豆素类成分的用量成为解决此问题的关键。但是我国对这方面的监督和管理仍不完善,缺乏合适的检测方法解决有害香豆素类成分的限量检测问题。因此为了维护社会的和谐稳定,保障人民群众的健康,促进各行业的健康发展,建立一套简便又实用的香豆素类成分的检测方法,来监督香豆素类成分在各行各业中的正确和安全的使用,是让香豆素此类“隐形杀手”“远离人类健康的有效办法。目前,对香豆素类成分的检测主要面临以下问题。第一,国内外关于香豆素类化合物的检测方法较多,但是主要是同时针对其中某几种成分进行测定,遗漏大多数香豆素成分。如果需要测定多种有害香豆素类成分,就需要一份样品反复测定多次,操作过程繁琐,分析时间漫长且浪费大量的有机试剂,严重污染生态环境。第二,实际测试样品中基质非常复杂,香豆素类成分的检测经常受到基质的干扰,造成定性、定量不准确。第三,采用任何一种检测方法均具有一定的局限性,难以保证所得到的结果的可靠性,所以在一种检测方法的基础上,再建立不同检测方法进行验证,以实现方法之间的互补,将会高质量的保证实验结果的准确性。第四,对香豆素类成分检测的需求不断的增多,如何快速、准确、特异的检测香豆素类成分,提高检测的通量,成为限制分析测试行业发展主要的“瓶颈”。传统的液相色谱的分析速度较慢,已经难以满足每天上百份样品测定的要求。现今采用超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）快速筛查法,将大大提高检测的效率,在香豆素类成分的检测领域发挥重要的作用。本研究课题结合最新的超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）决速筛查法,建立香豆素类化合物的快速检测方法,并建立了相对应的高效液相检测方法（HPLC）,从而较好的解决了上述的难题。本研究课题选取24种常见易致敏香豆素类成分,对其质谱碰撞诱导裂解（CID）规律进行了研究。并在此基础上建立了22种香豆素类成分的UPLC-MS/MS同时快速筛查方法。并应用于中成药检测领域,对非处方中成药都梁滴丸进行了筛查和含量同时测定。为非处方中成药都梁滴丸的质量与安全控制建立了有效的监测方法,为防止非处方中成药的滥用提供了科学的监测方法。其次,根据检测方法互补的原理,本研究又采用高效液相色谱（HPLC）法对中成药都梁滴丸中香豆素类成分的含量进行同时测定。为中成药检测结果的准确性进行了高水平的保证。本研究考虑到中成药具有化学成分多,类型差异大,基质复杂的特点,同时考虑结合香豆素类成分共同的化学性质,采用了UPLC-MSMS对22种香豆素类成分建立了快速筛查方法。首先,对质谱条件进行了优化,选择了最佳的多反应检测（MRM）模式的质谱条件；其次,对色谱柱,流动相和色谱条件进行了优化,选择较为普遍的Acquity BEH C18柱,乙腈,水作为流动相,梯度洗脱。在6分钟内实现了快速分析；再次,分别考察了香豆素类成分在中成药（本课题以都梁滴丸为例）中的提取方法。采用快速、简便的超声提取法,依次考察了超声溶剂和时间对提取回收率的影响。进一步开发了固相萃取技术（SPE）纯化方法,针对香豆素类成分进行了除杂,以减小基质效应。最后,采用所建立的对都梁滴丸中的香豆素类成分进行了筛查,结果发现都梁滴丸中含有5-甲氧基补骨脂素（5-MOP）、8-甲氧基补骨脂素（8-MOP）、欧前胡素进行了含量的测定。检测并发现都梁滴丸中含有5-甲氧基补骨脂素、8-甲氧基补骨脂素两种易致敏成分。因此本研究对都梁滴丸不良反应的控制和都梁滴丸质量标准的建立提供了,有利的分析手段支持。本项检测方法具有、快速（用时6分钟）、灵敏（最低定量限为ppb级）、准确、特异、稳定的优点,能够满足香豆素类成分在复杂的中成药基质中快速检测的要求。本课题又采用高效液相（HPLC-DAD）检测法,对都梁滴丸中的5-甲氧基补骨脂素、欧前胡素、异欧前胡素、阿魏酸进行了同时含量测定方法的建立。前处理方法采用超声提取法,分别以提取回收率为指标考察了提取的溶剂和提取的时间。此方法在30分钟对4种目标化合物进行了有效的分离,且特异性强,能较好的避开基质的干扰。此方法具有简便、较快速、灵敏、准确的特点,从另一种检测方法的角度对香豆素类成分进行了检测,并支持了UPLC-MSMS检测法得出的实验结果。因为该方法的仪器普及率较高、成本低廉,所以适用于基层药检部门的实际样品检测使用。但是,从此方法于UPLC-MS/MS法比较发现,8-甲氧基香豆素难以与基质分离,定量定性困难。最后本课题采用了HPLC-DAD检测法对化妆品中17种易致敏香豆素类成分进行了同时检测方法的建立。因为香豆素类成分具有特别的香气,所以不法厂商会添加香豆素类成分来改善产品的气味。因此化妆品中的呋喃香豆素类成分一直是欧盟化妆品法规所限制使用的成分。检测化妆品中的香豆素类成分,为保障人类的健康有着重要意义。本实验首次建立了化妆品中17种易致敏香豆素类成分的检测方法,方法具有快速、简便、灵敏、准确的特点。定量限均为0.5ug/ml,浓度在0.5～50 ug/ml范围内线性关系良好,日内精密度RSD%为0.87%～2.05%,日间精密度RSD%为0.81%～2.03%。稳定性RSD%为0.31%～1.57%,加样回收率在82.3%～102.9%之间,RSD%（n=6）为0.27～3.23%。能够满足欧盟化妆品法规的限量要求,适合于日常化妆品检验的要求。综上所述,本课题建立了香豆素类化合物的1项筛查方法和2项含量测定方法。对中成药和化妆品领域的香豆素类成分的检测建立了高效的检测平台,并对都梁滴丸等样品进行实际应用的研究,具有较好的实际应用价值。为防止香豆素类成分的滥用,提供了系列的检测监督方法。且从不同的检测方法验证了检测的准确性.

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 1 香豆素类化合物基础研究概况
• 参考文献:
• 2 香豆素类化合物的检测方法的研究进展
• 2.1 香豆素类成分高效液相色谱法检测的概述
• 2.2 香豆素类成分液相色谱质谱联用法检测的概述
• 2.3 超高效液相色谱质谱联用技术在中药分析领域中的应用
• 参考文献
• 3 都梁滴丸的研究概述
• 3.1 都梁滴丸中的香豆素类化学成分
• 3.2 都梁滴丸的药理活性的研究进展
• 参考文献
• 4 化妆品中香豆素类致敏物的检测方法的进展
• 参考文献
• 第二部分 实验研究
• 第一章 香豆素类成分超高效液相-串联质谱法检测方法的研究
• 前言
• 第一节 香豆素类成分电喷雾质谱裂解规律的研究
• 材料和方法
• 1.1 仪器与材料
• 1.2 实验条件及方法
• 结果与讨论
• 2.1 质谱条件的选择
• 2.2 质谱结果分析
• 第二节 22种香豆素的液相及前处理方法的研究
• 材料与方法
• 1.1 仪器与材料
• 1.2 条件及方法
• 结果与讨论
• 2.1 色谱柱及流动相的筛选
• 2.2 标准曲线、最低定量限及线性方程的测定测定结果
• 2.3 固相萃取条件的优化
• 小结
• 参考文献
• 第三节 中药都梁滴丸中香豆素类成分的筛查及同时含量测定方法的建立
• 前言
• 材料和方法
• 1.1 仪器与试剂
• 1.2 实验条件及方法
• 结果与讨论
• 结论
• 参考文献
• 第二章 都梁滴丸中香豆素和酚酸成分HPLC同时检测方法研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果与讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三章 化妆品中禁限用17种香豆素类成分的HPLC检测方法研究
• 前言
• 材料和方法
• 1.1 仪器与试剂
• 1.2 液相色谱条件
• 1.3 标准溶液的配置
• 1.4 前处理方法
• 结果与讨论
• 2.1 前处理条件的选择
• 2.2 色谱条件的选择
• 2.3 标准曲线和定量限
• 2.4 方法学考察
• 2.5 实际样品测定
• 小结
• 参考文献
• 结论
• 致谢
• 个人简历