羊胃肠线虫苯并咪唑类抗药性检测及PCR-SSCP分析

论文摘要

羊胃肠道线虫对驱虫药的抗药性已成为全世界面临的严重问题。我国在该方面的研究相对较少,鉴于目前养羊生产中存在的问题和寄生虫病防制的需要,本课题从以下三个方面对常用驱虫药的抗药性进行了研究,结果如下:（1）对宁夏某地区分离的一株可疑抗苯并咪唑类（Benzimidazoles,BZs）的捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）进行了人工诱导选择。孵化试验测得该虫株初始ED50值为0.057μg/ml。通过人工进一步诱导选择后的抗苯并咪唑类ED50值为0.146μg/ml,超过世界兽医寄生虫促进协会（WAAVP）所推荐的抗苯并咪唑类药物临界值。（2）以人工选择的抗苯并咪唑虫株和敏感株作对照,用改良的幼虫发育试验（LDA）检测了5家羊场的田间样品,建立了用幼虫发育试验技术,检测苯并咪唑类（Benzimidazoles,BZs）、左旋咪唑（Levamisole,LEV）、阿维菌素类（Avermectins,IVMs）药物抗药性的方法。（3）对来自田间的181份捻转血矛线虫雄虫样品,用PCR-SSCP技术分析其β-微管蛋白部分基因片段,结果表明药物处理后的样品中,突变基因型占20%（3/15）、杂合基因型占60%（9/15）、正常型占20%（3/15）;其余自然感染群体样品则分别为3.6%（6/166）、7.8%（13/166）和88.6%（147/166）。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 文献综述
• 1 抗药性的分布
• 2 国内外研究进展
• 2.1 国外研究情况
• 2.2 国内研究进展
• 3 线虫抗药性机理
• 4 抗药性产生的影响因素
• 5 抗药性的检测方法
• 5.1 活体试验
• 5.2 离体试验
• 5.3 PCR 技术
• 5.4 PCR-SSCP 分析方法
• 5.4.1 PCR-SSCP 方法的基本原理
• 5.4.2 PCR-SSCP 方法的特点
• 5.4.3 PCR-SSCP 在寄生虫学中的应用
• 5.5 抗药性检测方法展望
• 6 抗药性控制对策
• 6.1 宏观防治策略
• 6.2 基本防治对策
• 7 本研究的目的与意义
• 实验部分
• 试验一抗苯并咪唑类虫株的人工诱导选择
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要仪器和用具
• 1.1.2 实验动物
• 1.1.3 虫株来源及种类
• 1.1.4 主要试剂及配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 诱变前可疑抗药性虫株的检测
• 1.2.2 抗药性虫株的诱变选择
• 1.2.3 选择后虫株的接种及检测
• 2 结果
• 2.1 选择前疑似抗药性虫体种群虫卵孵化试验结果
• 2.2 三种不同药物浓度虫卵孵化率
• 2.3 选择后抗药性虫株虫卵孵化试验结果
• 3 讨论与分析
• 3.1 试验结果分析
• 3.2 试验方法讨论
• 3.2.1 虫卵孵化试验
• 3.2.2 人工诱变选择
• 实验二 幼虫发育试验对抗药性的检测
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要仪器
• 1.1.2 实验动物及样品
• 1.1.3 虫株来源
• 1.1.4 药物与试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 虫卵收集与纯化
• 1.2.2 幼虫发育试验
• 2 结果
• 2.1 敏感虫株虫卵孵化试验结果
• 2.2 抗药株与敏感株幼虫发育试验对比结果
• 2.3 幼虫发育试验田间检测结果
• 2.3.1 幼虫发育实验对包头土右旗散养户羊群检测结果
• 2.3.2 幼虫发育实验对鄂尔多斯达拉特旗散养户羊群检测结果
• 3 讨论与分析
• 3.1 试验结果分析
• 3.2 试验方法讨论
• 试验三抗药性虫株的PCR-SSCP 分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要仪器
• 1.1.2 虫株来源
• 1.1.3 主要试剂及溶液配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 基因组DNA 提取
• 1.2.2 捻转血矛线虫抗性株 β-微管蛋白基因组 DNA 扩增
• 1.2.3 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2 结果
• 2.1 DNA 提取结果
• 2.2 PCR 结果
• 2.3 SSCP 结果
• 3 讨论与分析
• 3.1 结果分析
• 3.2 PCR-SSCP 方法在抗药性检测中的应用
• 3.3 实验方法讨论
• 3.3.1 DNA 提取
• 3.3.2 PCR 扩增
• 3.3.3 PCR-SSCP 实验技术
• 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 作者简介