耐盐橙色粘球菌Myxococcus fulvus HW-1社会行为对海洋生境适应的分子策略

论文摘要

粘细菌是研究细菌社会行为的良好模式材料,其社会行为主要表现在滑动运动、摄食和多细胞协调发育过程,而滑动运动在细胞摄食和子实体发育过程中发挥着非常重要的作用。黄色粘球菌（Myxococcus xanthus）的滑动运动由两个独立的遗传系统调控:一个是A运动系统,主要调控独立的单个细胞运动;另一个是S运动系统,主要调控群体细胞运动。S运动系统主要包括三个组分:Ⅳ型菌毛、细胞外基质和O-抗原。黄色粘球菌的运动调控系统非常复杂,迄今为止,发现的S运动系统相关基因已超过110个。二十世纪末以前,粘细菌被普遍认为是典型的土壤微生物,分离的陆生菌株不能够在高于1%的盐浓度条件下生长。而从1998年日本学者在海洋样品中分离到嗜盐粘细菌以来,越来越多的粘细菌从多种海洋环境中分离纯化出来。根据耐盐能力的不同,海洋粘细菌被分为两类:海洋嗜盐粘细菌和海洋耐盐粘细菌。海洋嗜盐粘细菌主要是由日本学者分离到的,根据形态学特征和16S rDNA的分析,这些菌株被归为四个新的属。他们对海洋嗜盐粘细菌的研究主要集中在形态学分析、分类以及抗生素等代谢产物分析方面,而关于粘细菌在海洋生境中的生活模式、定殖机制及更深入的分子机制等方面一直都没有涉及。本实验室经过多年的探索,从海洋样品中分离到了多株海洋耐盐粘细菌。前期实验中,将其中的橙色粘球菌Myxococcus fulvus HW-1菌株作为一株典型的耐盐粘细菌模式菌株,与其它耐盐粘细菌或嗜盐粘细菌对比,对其形态学、生理学和系统分类学等特征及运动和发育能力进行了详细的分析。揭示了海洋耐盐粘细菌在陆地和海洋生境下存在两种不同的生活模式;并由实验结果推测海洋耐盐粘细菌是陆生粘细菌被带到海洋生境中适应了海水环境而存活下来,即海洋耐盐橙色粘球菌M.fulvus HW-1生活在海洋生境中是适应进化的结果。并且发现,在海水条件下,海洋耐盐粘球菌M.fulvus HW-1不仅保留了双运动系统,且双运动能力尤其是S运动能力明显增强。S运动的增强可能促进细胞间的粘连,为更好的适应海洋生境提供条件,证明社会运动在海洋耐盐粘球菌M.fulvus HW-1适应海洋生境生存过程中发挥着非常重要的作用。探知自然生境下粘细菌运动系统的多样性和对环境的适应可能为我们理解粘细菌运动系统的形成和进化提供重要线索。mariner转座因子是来自真核生物的mariner/Tc1超家族的成员,与原核生物的转座子如Tn5相比,有着多种独特的性质,如结构简单、转座作用不依赖宿主的特定因素和随机插入等,这些特性使其在自然界中广泛分布,并可在物种间水平转移。目前,已有多篇文献报道mariner转座因子可以在粘细菌中有效地转座,并且达到稳定整合,是粘细菌遗传研究的有力工具之一。本研究以海洋耐盐橙色粘球菌M.fulvus HW-1为材料,建立了一整套适合耐盐粘球菌的分子遗传操作体系,为开展耐盐粘细菌运动和发育等细胞行为的分子遗传学研究搭建了基础平台;在此基础上,利用mariner类转座子MiniHimarl-lacZ构建了HW-1菌株的小型随机插入突变菌库,从中发现并深入研究了一个社会运动和发育相关的新基因簇mts,该结果不仅扩充了粘球菌社会运动和发育相关基因文库,弥补了在模式菌株DK1622中筛选失活后对运动仅有微弱影响基因困难的不足,为粘球菌运动基因的筛选提供了新途径和新思路,而且开启了在分子水平上研究海洋耐盐粘细菌社会行为对海洋生境适应机制的大门,为理解HW-1社会行为对海洋生境适应的分子机制提供了重要依据。实验中,为了研究与M.fulvus HW-1适应海洋生境相关的S运动系统基因,首先将mariner类转座子MiniHimarl-lacZ电转化入M.fulvus HW-1细胞,通过随机插入突变的方法建立了M.fulvus HW-1菌株的随机突变菌库,从中筛选到一株社会运动缺陷突变株M.fulvus HL-1。利用报告基因lacZ的表达验证了突变株HL-1染色体上插入了转座子MiniHimarl-lacZ,并且发现突变基因表达时间很早、表达水平很高。双运动能力分析的经典方法——“软硬琼脂方法”分析结果显示:突变株M.fulvus HL-1 S运动能力缺陷,A运动能力受到影响;且令人兴奋的是,该突变株在海水条件下运动能力增强的趋势明显减弱、甚至消失,证明突变株M.fulvus HL-1中的突变基因在海洋耐盐橙色粘球菌M.fulvus HW-1在海水条件下S运动能力增强行为中发挥着重要的作用。通过发育平板上发育能力的检测证明了突变株M.fulvus HL-1的子实体形成和粘孢子发育能力缺陷。分析S运动系统的重要组分细胞外基质的染料结合实验、聚集实验和扫描电镜观察实验结果充分证明了突变株M.fulvus HL-1细胞外基质数量减少,细胞粘连性降低。这些实验结果表明:突变株M.fulvus HL-1中的突变基因可能在M.fulvus HW-1社会行为（运动和发育）中、甚至在社会行为对海洋生境适应过程中发挥着非常重要的作用。通过质粒营救法和Tail-PCR方法获得了突变株M.fulvus HL-1中转座子MiniHimarl-lacZ插入位点两侧13 kb序列。通过ORF分析软件FramePlot 3.0beta分析预测该片段编码6个功能相关的同向转录ORFs。Genbank上BLASTX比对结果表明:在黄色粘球菌Myxococcus xanthus DK1622和粘细菌中与粘球菌同亚目的另一个菌株橙色标桩菌Stigmatella aurantiaca DW4/3-1基因组上,均有该6个ORFs的高度同源基因,且中间4个ORFs及其在DK1622和DW4/3-1中的同源ORFs都与主要来自真核生物的、与细胞的粘附、运动和增殖等多种细胞行为密切相关的Thrombospondin type 3 repeat家族蛋白同源。因此该基因簇被命名为mts（意指myxobacterial thrombospondin-like）,分别编码MtsA、MtsB、MtsC、MtsD、MtsE和MtsF蛋白。在突变株HL-1中,转座子MiniHimar1-lacZ插入在ORF mtsC的3’末端。结构域预测软件SMART分析结果显示:MtsA和MtsE N端均有一个穿膜结构域,MtsD和MtsE均具有通常在细胞粘连等行为中发挥着重要作用的VWA[von Willebrand factor（vWF）type A domain]结构域。信号肽分析软件SignalP分析结果表明MtsA、MtsC、MtsD、MtsE和MtsF蛋白均具有信号肽。这些分析结果与突变株HL-1的社会行为和细胞外基质等表型分析结果一致,表明Mts蛋白可能定位在细胞膜上,构成细胞外基质的一部分,参与细胞的粘连、运动和发育等社会行为。由于M.fulvus HW-1菌株的突变频率非常低,在该菌株中对mtsC基因的缺失一直没有成功。而令人欣慰的是,在同一属的菌株M.xanthus DK1622基因组上,有6个氨基酸一致性均高于85%的mts高度同源基因,无论是排列顺序还是转录方向都与M.fulvus HW-1的mts基因簇完全一致。因而利用M.xanthusDK1622中mts同源基因的功能分析来验证mts基因的功能是一条很好的途径。M.xanthus DK1622菌株中mtsC同源基因插入失活后,突变株在软琼脂上的菌落形态与HL-1突变株一样,呈锯齿状,证明mtsC同源基因在黄色粘球菌的S运动中可能发挥着重要的作用。通过lacZ报告基因的表达分析证明了mtsC同源基因的表达情况与mtsC基因基本一致,表达水平较高,表达时间较早。这些结果充分说明用M.xanthus DK1622中mts同源基因的定点突变来验证mts基因的功能是适合的。通过菌落扩展能力的分析比较证明了mtsC同源基因的插入失活对M.xanthus DK1622运动能力的影响远低于mtsC插入失活对M.fulvus HW-1运动能力的影响。该结果与PHX（predicted highly expressed）分析软件预测的mts及其同源基因表达水平结果一致,说明与mtsC同源基因在陆生粘球菌M.xanthusDK1622运动过程中发挥的作用相比,mtsC在海洋耐盐粘球菌M.fulvus HW-1运动过程中发挥的作用更重要,即mtsC甚至整个mts基因簇可能在M.fulvus Hw-1社会行为对海洋生境适应过程中发挥着非常重要的作用。通过mtsC同源基因缺失突变及与已知A和S运动基因分别构建的双基因突变的分析,证明了mtsC同源基因属于S运动系统基因,在M.xanthus DK1622的S运动和发育过程中发挥着重要的作用。mts同源基因簇的缺失证明mts同源基因簇可能在M.xanthus DK1622的S运动和发育过程中发挥着重要的作用。通过其它mts同源基因缺失的分析证明了mtsA、mtsB、mtsD、mtsE和mtsF同源基因均在M.xanthus DK1622的S运动中发挥着重要的作用;而除mtsF外,mtsA、mtsB、mtsD和mtsE同源基因也均在M.xanthus DK1622的子实体形成和粘孢子发育过程中占有重要的地位。为了在粘球菌中对MtsB同源蛋白进行细胞定位,构建了荧光蛋白与MtsB同源蛋白融合表达菌株,但在该菌株细胞中没有检测到荧光。通过lacZ报告基因的分析显示了融合蛋白能够表达,但不能正常发射荧光。在大肠杆菌中,异源表达了MtsB及其同源蛋白MXAN1333。通过表达细胞破碎液离心后沉淀和上清液中蛋白的分析确认了表达的融合蛋白MtsB和MXAN1333多数都呈包涵体形式。提取、纯化了融合蛋白MtsB和MXAN1333,并制备了融合蛋白MtsB和MXAN1333的多克隆抗体,为MtsB及其同源蛋白的细胞定位和表达时间谱等功能机制分析奠定了坚实的基础。通过紫外诱变对M.fulvus HW-1进行了改造,获得了一株在液体培养基中均匀稳定分散生长诱变株M.fulvus UV684。对UV684进行了形态学特性、耐盐能力和运动能力的分析,显示了分散生长对粘球菌的营养细胞和粘孢子的形态特征、耐盐能力、A运动能力和海水条件下运动能力增强特性等基本没有影响,但可能导致子实体发育能力和S运动能力下降。通过电转化突变频率确认了HW-1经过诱变改造后适合遗传操作;显示粘球菌细胞分散生长后,对其遗传操作会更容易,为粘细菌和其它聚团生长菌株的遗传操作研究提供了线索。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明及缩写词
• 第一章 文献综述
• 1.1 粘细菌的滑行运动
• 1.1.1 黄色粘球菌的双运动系统
• 1.1.2 mgl和frz基因座
• 1.1.3 黄色粘球菌的滑动运动特性
• 1.2 粘细菌的子实体发育
• 1.2.1 粘细菌子实体发育的形态生成
• 1.2.2 粘细菌子实体发育过程中的信号
• 1.3 海洋粘细菌的研究
• 1.3.1 海洋嗜盐粘细菌
• 1.3.2 海洋耐盐粘细菌
• 1.4 mariner转座因子及其应用
• 1.4.1 mariner转座因子概述
• 1.4.2 mariner转座因子的转座机制
• 1.4.3 mariner转座因子的应用
• 1.5 本文工作开展的思路及研究内容
• 第二章 耐盐橙色粘球菌M.fulvus HW-1社会运动突变株的筛选及性质分析
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株及质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 实验试剂
• 2.1.4 仪器设备与耗材
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 质粒pMiniHimar1-lacZ的酶切验证和提取
• 2.2.2 抗生素卡那霉素抗性分析
• 2.2.3 转座子突变及社会运动突变株的筛选
• 2.2.3.1 电转化
• 2.2.3.2 社会运动突变株的筛选
• 2.2.4 突变子的保存
• 2.2.5 X-gal平板显色实验
• 2.2.6 运动能力的分析
• 2.2.7 子实体形成和粘孢子发育能力的分析
• 2.2.8 细胞外基质与染料结合能力分析
• 2.2.9 细胞聚集实验
• 2.2.10 扫描电子显微镜分析细胞外基质
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 M.fulvus HW-1随机突变菌库的建立
• 2.3.1.1 质粒pMiniHimar1-lacZ的分析验证及大量提取
• 2.3.1.2 转座子MiniHimar1-lacZ电转化橙色粘球菌HW-1
• 2.3.1.3 电转化突变子的保存
• 2.3.2 社会运动突变株的筛选
• 2.3.3 社会运动突变株表型检测及性质分析
• 2.3.3.1 运动能力的检测
• 2.3.3.2 子实体和粘孢子发育能力检测
• 2.3.3.3 细胞外基质的分析
• 2.4 本章小结
• 第三章 运动与发育相关基因簇mts的克隆分析及功能验证
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株及质粒
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 实验试剂
• 3.1.3 仪器设备与耗材
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 粘球菌基因组DNA的提取
• 3.2.2 突变子HL-1中转座子插入位点的确定
• 3.2.3 Tail-PCR
• 3.2.4 基因簇mts的生物信息学分析
• 3.2.5 质粒载体的构建
• 3.2.5.1 目的片段的克隆及处理
• 3.2.5.2 质粒载体的酶切及连接转化
• 3.2.5.3 质粒构建的流程图
• 3.2.6 黄色粘球菌的电转化及突变株的筛选和纯化
• 3.2.6.1 黄色粘球菌的电转化
• 3.2.6.2 插入失活突变株的筛选和纯化
• 3.2.6.3 缺失突变株的筛选和纯化
• 3.2.7 运动能力的检测
• 3.2.8 子实体形成和粘孢子发育能力的检测
• 3.2.9 X-gal平板显色实验
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 基因簇mts的克隆与分析
• 3.3.2 M.fulvus HW-1 mtsC基因的缺失
• 3.3.3 M.xanthus DK1622中mts同源基因簇的功能和表达分析
• 3.3.3.1 mtsC同源基因的插入失活及功能和表达分析
• 3.3.3.2 mtsC同源基因和mts同源基因簇的缺失突变及功能分析
• 3.3.3.3 DK1622中其它mts同源基因的缺失突变及功能分析
• 3.4 本章小结
• 第四章 MtsB及其同源蛋白的功能机制初探
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌株及质粒
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 实验试剂
• 4.1.4 仪器设备与耗材
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 质粒载体的构建
• 4.2.1.1 引物的设计及合成
• 4.2.1.2 质粒构建的流程图
• 4.2.2 荧光蛋白融合表达菌株的构建
• 4.2.2.1 电转化黄色粘球菌
• 4.2.2.2 荧光蛋白融合表达菌株的筛选和纯化
• 4.2.3 荧光的检测
• 4.2.4 X-gal平板显色实验
• 4.2.5 融合蛋白在大肠杆菌中的异源表达及检测
• 4.2.6 融合蛋白包涵体的提取和纯化
• 4.2.6.1 包涵体的提取
• 4.2.6.2 融合蛋白的镍柱纯化
• 4.2.7 蛋白浓缩及浓度的检测
• 4.2.7.1 蛋白的浓缩
• 4.2.7.2 蛋白浓度的检测
• 4.2.8 融合蛋白抗体的制备
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 荧光蛋白融合表达对MtsB同源蛋白的细胞定位
• 4.3.1.1 绿色和红色荧光蛋白的应用
• 4.3.1.2 双报告系统对荧光融合表达技术的分析
• 4.3.2 MtsB及其同源蛋白的异源表达
• 4.3.2.1 表达质粒pET-mtsB和pET-1333的构建
• 4.3.2.2 MtsB和MXAN1333蛋白的异源表达和纯化
• 4.3.3 融合蛋白MtsB和MXAN1333抗体的制备
• 4.4 本章小结
• 第五章 M.fulvus HW-1分散生长诱变株的筛选和性质分析
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 菌株及质粒
• 5.1.2 培养基
• 5.1.3 实验试剂
• 5.1.4 仪器设备与耗材
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 紫外诱变
• 5.2.2 分散生长能力的检测
• 5.2.3 普通形态学分析
• 5.2.4 运动能力的检测
• 5.2.5 耐盐能力分析
• 5.2.6 电转化
• 5.2.7 转化突变子假阳性分析
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 分散生长突变株的筛选
• 5.3.2 M.fulvus UV684菌株性质分析
• 5.3.2.1 形态学性质的分析
• 5.3.2.2 耐盐能力的分析
• 5.3.2.3 运动能力的分析
• 5.3.3 M.fulvus UV684菌株的遗传操作
• 5.4 本章小结
• 总结与展望
• 附录
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 学位论文评阅及答辩情况表
• 附发表文章