小庙洪牡蛎礁巨蛎属牡蛎间生殖隔离研究

论文摘要

中国牡蛎种类丰富,但是由于贝壳可塑性强,表型变化大,分类学及系统发生学研究进展缓慢,存在诸多争议。本文在全国部分海区采集牡蛎样品,并通过表型和分子生物学方法进行鉴定,重点调查潮下带牡蛎的分布情况。选取江苏南通小庙洪牡蛎礁作为典型海域,研究亲缘关系接近的巨蛎属牡蛎之间在繁殖上如何维持相互之间的关系。本研究的目的在于摸索牡蛎物种鉴定的实用方法,并阐明熊本牡蛎和近江牡蛎生殖隔离是如何维持的。研究结果对牡蛎等海洋贝类的分类及系统发生学研究具有一定的借鉴作用,为牡蛎礁的生态保护提供生物学参考依据。在辽宁营口、海洋岛,河北秦皇岛,山东西霞口、潍坊、青岛,江苏南通,浙江舟山、奉化,福建莆田,广东汕头等地区采集牡蛎样品,重点采集潮下带的牡蛎,通过地理分布、表型、DNA含量测定和COI种特异性探针鉴定对各地区的牡蛎物种组成进行分析。选取了南通小庙洪牡蛎礁作为研究牡蛎物种间相互关系的最佳地点。该地区牡蛎由主要分布在潮间带的熊本牡蛎和主要分布在潮下带的近江牡蛎组成。对南通小庙洪牡蛎礁上两种巨蛎属牡蛎在空间上的分布进行调查;定期取样,制作性腺切片,观察两种牡蛎的性腺发育情况;同时,定期在海区挂板,采用半人工采苗的方式采集海区牡蛎幼体,通过ITS1基因鉴定采集的稚贝所属物种。通过调查发现二者的分布存在重叠区域;两种牡蛎在2007年6月中旬至9月中旬存在两个明显的繁殖高峰期,在每个繁殖期内两种牡蛎同时发生大量繁殖行为的可能性极高。结果表明,两种牡蛎不存在明显的生态隔离和季节隔离等交配前生殖隔离机制。在室内对两种牡蛎进行2×2完全双列杂交,并通过ITS1基因的克隆测序验证杂种后代。双列杂交受精实验采用多亲本混合交配的方式(即每个物种的卵子或精子均来自多个个体),共进行7次重复。结果表明,熊本牡蛎的卵子能够被近江牡蛎的精子以较低的受精率(24.6%)受精,且形成的后代确实为两个物种杂交产生,而反方向不能受精。幼虫和稚贝生长存活的双列杂交实验共进行3次重复。估测受精率、受精卵的孵化率,第1至29日每两天测量一次D形幼虫的壳高和密度。结果表明杂交幼虫(熊本牡蛎♀与近江牡蛎♂的杂交,SA)的受精率(12.5%)显著低于(P < 0.05)熊本牡蛎(75.4%)和近江牡蛎(84.5%)纯种对照组;而孵化率与对照组无显著差异(P > 0.05);自受精至29日龄,杂交幼虫壳高的生长速度明显低于纯种对照组(P < 0.05);但是存活率与熊本牡蛎无显著差异(P > 0.05)。杂交幼虫附着变态期间死亡率高;93日龄,熊本牡蛎有10.08%的匍匐期面盘幼虫存活至稚贝,显著大于(P < 0.05)近江牡蛎(2.18%)和杂交幼虫(0.76%);杂交稚贝壳高显著小于(P < 0.05)纯种对照组。稚贝在海区挂养3个月。与挂养前相比,杂交稚贝在潮下带的存活率为19.2%,125个稚贝仅存24个,壳高平均增加2.15 mm。熊本牡蛎在潮间带的存活率达到65%,壳高平均增加3.99 mm。近江牡蛎在潮下带的存活率达到85.7%,壳高平均增加5.22 mm,在潮间带的存活率仅10.9%,壳高平均增加3.28 mm。受精6个月后,所有杂交稚贝仅剩3枚,运回实验室暂养一段时间后全部死亡。设置20、25、30、35共4个盐度梯度,估算双列杂交组合在不同盐度下的受精率、孵化率、7日内的存活率和壳高生长,实验共进行3个重复。结果表明,杂交组合在4个盐度下的受精率(平均为11.2%)均显著低于(P < 0.05)熊本牡蛎(75.0%)和近江牡蛎(77.5%)纯种对照组;而孵化率与对照组无显著差异(P > 0.05);杂交组合在盐度35时的孵化率(85.0%)显著大于20(49.6%)、25(51.3%)和30(55.4%)三个盐度梯度。7日龄杂交幼虫(10.5%)和近江牡蛎(11.4%)的存活率显著小于(P < 0.05)熊本牡蛎(30.3%);杂交幼虫的壳高(75.7μm)显著小于(P < 0.05)熊本牡蛎(81.5μm)和近江牡蛎(85.6μm)对照组。两因素方差分析表明,杂交组合方式对受精率、孵化率、7日龄存活率和7日龄壳高均有显著影响,盐度对7日龄壳高的影响显著。实验结果表明,江苏小庙洪牡蛎礁上的熊本牡蛎和近江牡蛎之间在分布空间上存在重叠区域,繁殖时间也存在重叠,并未产生明显的生态隔离和季节隔离。二者之间存在不对称性杂交,熊本牡蛎的卵子能够与近江牡蛎的精子以较低的受精率受精,而反方向完全不亲和。杂交幼虫在受精率上存在显著劣势;但是受精卵的孵化率与纯种受精卵无显著差异;杂交幼虫在生长上也存在显著劣势;而存活率与熊本牡蛎无显著差异;杂交幼虫附着变态期间大量死亡,存活下来的稚贝生长缓慢,死亡率高。表明熊本牡蛎和近江牡蛎之间即存在交配前的配子不亲和性隔离,又存在交配后隔离,主要表现为杂种不活。

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Abstract

第一章综述

第一节生物学的哲学

第二节物种的定义

第三节生物系统学与物种的形成

第四节杂交

第五节牡蛎和牡蛎礁

第六节牡蛎生殖隔离的研究意义及现状

第二章中国沿海牡蛎分布调查及南通典型海区的选择

第一节中国沿海牡蛎分布调查

2.1.1 样品采集及处理

2.1.2 物种鉴定

2.1.2.1 地理分布及表型鉴定

2.1.2.2 DNA提取

2.1.2.3 COI基因片段扩增

2.1.2.4 琼脂糖电泳检测

2.1.3 结果与分析

2.1.3.1 五种常见巨蛎属牡蛎COI特异性Marker的制作

2.1.3.2 物种鉴定结果

第二节中国沿海常见牡蛎物种的DNA含量分析

2.2.1 材料和方法

2.2.1.1 样品采集

2.2.1.2 样品处理

2.2.1.3 内标物种

2.2.1.4 样品测量

2.2.1.5 数据分析

2.2.2 结果与分析

第三节牡蛎总科（Ostreacea）各物种分子系统学的初步分析

2.3.1 材料和方法

2.3.2 结果和分析

第四节讨论

2.3.1 中国沿海的牡蛎分布

2.3.2 中国沿海各种牡蛎的DNA含量分析

2.3.3 典型研究海区的选择

第三章小庙洪牡蛎礁自然分布牡蛎的交配前隔离研究

第一节近江牡蛎和熊本牡蛎配子亲和性

3.1.1 材料与方法

3.1.1.1 亲贝的选择

3.1.1.2 配子的获得

3.1.1.3 实验设计与授精

3.1.1.4 受精率的估算

3.1.1.5 数据处理

3.1.2 结果与分析

第二节近江牡蛎和熊本牡蛎繁殖时间调查

3.2.1 材料和方法

3.2.1.1 实验设计

3.2.1.2 海区取样

3.2.1.3 海区挂板

3.2.1.4 海区环境测量

3.2.1.5 牡蛎物种鉴定

3.2.1.6 条件指数测量

3.2.1.7 性腺外部形态观察

3.2.1.8 性腺组织切片

3.2.1.9 数据统计

3.2.2 结果与分析

3.2.2.1 条件指数

3.2.2.2 性腺发育

3.2.2.3 性腺切片

3.2.2.4 半人工采苗分析结果

3.2.2.5 繁殖期和海域环境的关系

第三节讨论

3.3.1 配子不亲和

3.3.2 繁殖时间隔离

3.3.3 其他隔离机制

第四章小庙洪牡蛎礁自然分布牡蛎的交配后隔离研究

第一节近江牡蛎和熊本牡蛎杂交幼虫的分子生物学鉴定

4.1.1 材料与方法

4.1.1.1 亲贝的选择

4.1.1.2 配子的获得及授精

4.1.1.3 幼虫培养

4.1.1.4 稚贝的取样固定

4.1.1.5 亲贝和稚贝基因组DNA提取

4.1.1.6 IT51 基因的PCR扩增

4.1.1.7 琼脂糖电泳检测

4.1.1.8 割胶纯化

4.1.1.9 连接载体

4.1.1.10 转化感受态细胞

4.1.1.11 筛选阳性克隆菌落

4.1.1.12 产物测序分析

4.1.2 结果与分析

4.1.2.1 IT51 基因的扩增

4.1.2.2 阳性克隆筛选

4.1.2.3 IT51 基因测序及分析

第二节近江牡蛎和熊本牡蛎杂交幼虫的生长和存活

4.2.1 材料与方法

4.2.1.1 亲贝的选择

4.2.1.2 配子的获得及授精

4.2.1.3 幼虫培养

4.2.1.4 受精率的估算

4.2.1.5 孵化率的估算

4.2.1.6 幼虫的生长率和存活率

4.2.1.7 数据处理

4.2.2 结果与分析

4.2.2.1 受精率与孵化率

4.2.2.2 幼虫存活与生长

第三节近江牡蛎和熊本牡蛎杂交幼虫对不同盐度的适应能力

4.3.1 材料与方法

4.3.1.1 亲贝的选择

4.3.1.2 配子的获得及授精

4.3.1.3 盐度设计及受精卵的分配

4.3.1.4 幼虫培养

4.3.1.5 受精率的估算

4.3.1.6 孵化率的估算

4.3.1.7 幼虫的壳高和存活率

4.3.1.8 数据处理

4.3.2 结果与分析

4.3.2.1 受精率与孵化率

4.3.2.2 第7 天壳高增量与第7 天存活率

第四节近江牡蛎和熊本牡蛎杂交稚贝的生长和存活

4.4.1 材料与方法

4.4.1.1 稚贝来源

4.4.1.2 海区养殖实验设计

4.4.1.3 稚贝生长存活测量

4.4.1.4 数据处理

4.4.2 结果与分析

第五节讨论

第五章总结

参考文献

博士在读期间发表的学术论文

致谢

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