REGγ靶蛋白的探究

论文摘要

真核生物20s蛋白酶体是由四叠环组成的,7个α亚基组成的两个外环,七个p亚基组成两个内环,最终形成对称的桶装结构（α1-7β1-7β1-7α1-7）。 REGγ（PA28γ, PSME3）是蛋白酶体激活因子11s家族的一员,可以结合并激活20s蛋白酶体。迄今为止,只发现了几种REGγ靶蛋白,如SRC-3,p21,Smurfl, Smurf2, REGγ以非依赖ATP和泛素的方式降解这些蛋白,但是REGγ降解蛋白的机制还不清楚,REGγ其他的一些靶蛋白有待发现。在本研究中,我们从牛血红细胞中采用多步骤层析法纯化出20s,用一步亲和层析法纯化出REGγ,然后用纯化的20s和REGγ在体外降解疑似REGγ靶蛋白。REGγ在体外不能促进PKACα的直接降解,但在细胞内REGγ可以结合并调控PKACα的蛋白水平。我们也发现GST-REGγ和体外翻译α2,α6两个亚基有相互作用,而不和其他亚基相互作用,GST-REGγ的突变体N151Y也有相同趋势,但所有体外纯化的重组蛋白GST-α亚基都不和体外翻译的REGγ有相互作用,这暗示我们这种相互作用需要α亚基的某种修饰。总之,我们的研究为新的REGγ靶蛋白的发现和REGγ降解机制的研究提供了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 综述
• 第一节：REGγ与蛋白质酶体降解系统
• 1.1 蛋白酶体系统
• 1.2 20s蛋白酶体核心颗粒
• 1.3 REGγ的生物化学特性
• 1.4 REGγ的靶蛋白
• 1.5 20s蛋白酶体的纯化
• 第二节 PKA信号通路
• 2.1 PKA的同工酶
• 2.2 PKA同工酶的特征
• 第三节 本研究的目的与意义
• 第二章 ：实验材料与方法
• 第一节 实验材料
• 1.1 蛋白纯化所用主要试剂和层析柱
• 1.2 主要细胞
• 1.3 培养细胞主要试剂
• 1.4 主要试剂
• 1.5 蛋白纯化自配溶液
• 1.6 主要设备
• 第二节 实验方法
• 2.1 蛋白纯化方法
• 2.2 克隆的构建
• 2.3 免疫印记分析（Western Blotting）
• 2.4 免疫荧光
• 2.5 GST-pull down实验
• 第三章 ：实验结果与分析
• 第一节：蛋白酶体核心颗粒20s的纯化
• 1.1 纯化方案
• 1.2 过分子筛柱
• 第二节：蛋白酶体激活因子REGγ的纯化
• 2.1 纯化方案Ⅰ
• 2.2 纯化方案Ⅱ
• 2.3 纯化方案Ⅲ
• 第三节：REGγ蛋白酶体对底物的降解
• 3.1 REGγ降解靶蛋白
• 3.2 REGγ与20sα亚基的相互作用
• 3.3 体外纯化REGγ突变体七聚体的形成
• 第四节：REGγ对PKA Cα的调节
• 4.1 REGγ调节PKA Cα的蛋白水平
• 4.2 PKA Cα与REGγ蛋白酶体的相互作用
• 4.3 REGγ调控PKA信号通路
• 第五节：转录因子Smad3和突变型p53相互作用区域的确定
• 5.1 体外实验证明野生型p53和突变型p53和Smad3的相互作用能力较Smad2要强
• 5.2 确定Smad3与突变型或野生型p53相互作用区域
• 5.3 确定突变型或野生型p53与Smad3相互作用区域
• 5.4 确定突变型p53碳末端392位点是介导Smad3相互作用的若干重要位点之一
• 第四章 结论与展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢