PCR技术用于日本血吸虫感染检测研究

论文摘要

目前,血吸虫病仍是一种严重危害人类健康与阻碍疫区社会经济发展的寄生虫病,影响范围涉及亚非拉数十个国家和地区。近年来,随着我国血吸虫病防治工作的不断扩展和强度的不断加大,疫区人群血吸虫感染率与感染度显著降低,但感染者仍逾百万。高灵敏度的诊断手段可使患者得到早期治疗,改善生活质量,诊断在血吸虫病防治工作中占有极其重要的位置。血吸虫病诊断方法分直接诊断法与间接诊断法两类。作为WHO推荐用于现场诊断的直接诊断方法——改良加藤法（Kato-Katz）花费少且能半定量,为目前确诊血吸虫病的主要手段,但存在漏检率高的缺陷,在感染度低的地区尤为明显。血吸虫病间接诊断法主要为ELISA法,血清保存方便且实验操作简单,但不能区分现症感染与既往感染。因此,如需准确诊断个体血吸虫病,需要敏感性及特异性更高的检测手段。近年来出现的血吸虫病PCR检测已用于多种血吸虫病。多项研究显示,其敏感性与特异性均高于通常使用的血吸虫病检测方法,如改良加藤法与ELISA法等。然而,现有的PCR检测,均未对所构建方法的敏感性进行准确评估,而且仅做到定性检测。此外,很少有报道对粪样DNA提取方法进行客观合理的比较性研究。本研究采用计数虫卵与阴性粪样混合制备人工阳性粪样的方法,在严格质控下,建立了日本血吸虫特异的SYBR Green荧光定量粪样PCR检测法,精确评价了所用SYBR Green荧光定量粪样PCR检测法的敏感性,而且得到了PCR结果与粪样中虫卵数的对应关系,可望以PCR法精确测定日本血吸虫感染度。此外,为了探索经济有效的粪样DNA提取方法,我们还比较评估了四种粪样DNA提取方法（ROSE法,IRS-ROSE法,MoBio公司与QIAgen公司粪样DNA提取试剂盒法）。最后,为了探索灵敏特异经济,且能够用于现场检测的粪样PCR检测法,我们尝试了以日本血吸虫特异性重复序列为普通PCR靶基因用于检测日本血吸虫病的方法构建。本研究获得结果如下:1 SYBR Green荧光定量粪检PCR法对日本血吸虫感染检测的敏感性研究:以肝吸虫基因组DNA与阴性粪样中提取DNA进行SYBR Green荧光定量PCR特异性检测,结果均为阴性。所有混合血吸虫虫卵的人工阳性粪样,低至仅含一个虫卵的样本,SYBR Green荧光定量PCR结果均为阳性。本粪样PCR检测法单次检测粪样为200mg,其中仅含1个虫卵时,敏感性仍可达100%。本研究同时分析了人工阳性粪样、单独计数虫卵提取DNA模板的虫卵数量与Ct值间关系,用直线回归方程成功拟合lg（虫卵数+1）与Ct值关系（r2 >0.9）。本SYBR Green荧光定量粪样PCR检测法的关键步骤均设质控标准,严格质控,数据可信度高。2尚未建立可取代商业化试剂盒的,更经济有效的粪样DNA提取方法。本研究采用MoBio粪样DNA提取试剂盒法（UltraCleanTM Fecal DNA Sample Kit）、ROSE法与IRS-ROSE法分别提取含不同虫卵数目梯度的人工阳性粪样DNA,用SYBR Green荧光定量PCR检测提取DNA模板,研究结果提示与其他两种方法相比,MoBio粪样DNA提取试剂盒法下游SYBR Green荧光定量PCR检测敏感性高,含1个虫卵人工阳性粪样实时定量PCR结果均为阳性,与本研究第一部分中所用QIAgen粪样提取试剂盒检测结果相同。与之比较,IRS-ROSE法与ROSE法提取效果较差,IRS-ROSE法提取含5个虫卵的人工阳性粪样DNA模板本荧光定量PCR检测阳性,而ROSE粪样DNA提取法最低只检出含10个虫卵的人工阳性粪样。3构建用于粪样检测的普通PCR体系的尝试。采用日本血吸虫特异性重复序列为靶基因进行普通PCR检测。根据日本血吸虫特异性重复序列设计引物,使用普通PCR检测日本血吸虫感染。靶基因与引物的BLAST比对结果示与现在已入库的基因无同源性。本研究另选用肝吸虫基因组DNA与阴性粪样中提取DNA进行此PCR特异性检测,肝吸虫基因组与阴性粪样DNA模板检测结果阳性,但NTC（non template control,无模板对照）电泳结果为阴性,因此,此普通PCR特异性不佳。QIAgen粪样试剂盒提取含虫卵的人工阳性粪样本PCR检测结果均为阳性。分别感染1000条、500条尾蚴的家兔两只,感染4周,每周采血,提取血清DNA,PCR检测结果均为阴性。本研究创造性使用计数虫卵与阴性粪样混合制备人工阳性粪样的方法,对本研究所用SYBR Green荧光定量PCR检测体系的敏感性进行准确评估,建立了粪样中虫卵数量与定量PCR结果间数量关系。所用日本血吸虫病SYBR Green荧光定量粪样PCR检测法,具有灵敏度高、特异性强、可估计感染度等优点,丰富了血吸虫病PCR检测法的研究。本研究应用此粪检法评价了多种粪样DNA提取方法,但未能建立较商业化试剂盒更为经济有效的粪样DNA提取方法。最后,本研究尝试构建用于粪样检测的普通PCR体系,以日本血吸虫特异性重复性序列为靶基因采用普通PCR用于检测日本血吸虫病进行探索性研究,最终目的均为寻求经济而便捷,可适用于现场PCR检测。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 SYBR GREEN 荧光定量粪检PCR 法对日本血吸虫感染检测的敏感性研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 粪样 DNA 提取方法比较性研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 普通 PCR 检测日本血吸虫感染
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表文章情况
• 致谢