日粮纤维对猪体粪臭素沉积的调控及分子机理研究

论文摘要

粪臭素（3-甲基吲哚）是猪大肠内微生物降解L-色氨酸的产物,是引起公猪膻味的主要物质之一,易在脂肪组织中沉积,对猪肉风味有负面作用。本论文在研究猪体内粪臭素沉积规律的基础上（第一部分）,研究了不同发酵类型的纤维物质对猪直肠菌群作用下L-色氨酸体外代谢的影响（第二部分）,并通过动物试验进一步研究了纤维源对猪肠道粪臭素产生和组织沉积水平的影响,从肠道微生物区系组成和肝脏粪臭素代谢关键酶基因表达两个层次,探讨了纤维物质调控猪体粪臭素水平的机制（第三部分）。第一部分：猪体粪臭素沉积的时空变化规律研究,包括2个试验。试验一研究不同生长阶段猪体粪臭素沉积规律,并结合肝脏细胞色素P4502E1 （CYP2E1）和P450 2E1 （CYP2A6）基因表达水平探讨细胞色素P450酶系在调控粪臭素代谢上的作用。以30、90和150d的长白猪为对象,测定了猪体不同组织和血浆中粪臭素和吲哚水平、肝脏中CYP2E1和CYP2A6 mRNA表达水平和酶活。结果显示,随着年龄的增长,血浆和肝脏中粪臭素水平显著增加（P<0.05）；背脂中粪臭素水平呈增加趋势（P=0.061）；腹脂中粪臭素水平从30d到90d显著增加（P<0.05）。相似地,血浆、肝脏和脂肪中吲哚水平也随着日龄的增长而升高。除血浆外,组织中吲哚水平150d均显著高于30d。CYP2E1和CYP2A6 mRNA表达丰度先降低后升高,150d的表达量显著高于30d和90d（P<0.05）；但其酶活性没有明显差异。结果提示,在达到性成熟前猪体粪臭素沉积水平与CYP2E1和CYP2A6基因的表达无确定关系。试验二研究猪不同肠段粪臭素的产生规律,并结合肠道微生物区系组成以探讨与粪臭素生成相关的微生物学信息。选择150d纯种金华和长白公猪各3头,屠宰后迅速分离大肠,结扎为盲肠（Ce）、近结肠（PC）、远结肠（DC）和直肠（Re）四段,测定食糜中吲哚物质及挥发性脂肪酸（VFA）浓度,采用变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析肠道微生物区系组成,并测定结肠上皮细胞增殖和凋亡。结果发现,金华猪和长白猪肠道粪臭素和吲哚浓度从盲肠到直肠均逐渐上升,长白猪近结、远结和直肠浓度显著高于盲肠中的浓度（P<0.05）,长白猪直肠中的浓度显著高于金华猪（P<0.05）。换言之,肠段因素对粪臭素和吲哚的浓度有显著影响（P<0.001）,而品种没有显著影响,也不存在两者互作。长白猪直肠中支链脂肪酸比例（BCP）显著升高（P<0.05）,金华猪和长白猪肠道中总的吲哚物质浓度与BCP的变化规律基本一致。两个品种猪结肠细胞增殖和凋亡指数均没有显著差别。在金华猪粪臭素浓度较高的近结、远结和直肠样品出现的条带与Clostridium aminophium匹配。结果提示,不同个体及不同肠段微生物区系差别较大,发酵模式亦不同,可能是粪臭素浓度产生差别的主要原因。细菌C.aminophium可能在粪臭素的产生中起作用。第二部分：利用体外发酵技术,研究不同纤维来源对猪直肠细菌群作用下L-色氨酸体外代谢的影响。试验三探讨四种不同发酵类型的纤维物质对猪直肠菌群作用下L-色氨酸体外代谢生成粪臭素和吲哚的影响。将10%（w/v）粪水厌氧分装于无菌培养瓶中,分成5组：对照组添加250μM L-色氨酸,甜菜粕（SBP）、黑麦草（RYE）、苜蓿粉（ALF）和果寡糖（FOS）组分别在对照组的基础上添加1.0%的SBP、RYE、ALF和FOS,经38℃厌氧培养24h后,分析培养液中吲哚物质和VFA浓度及pH值；采用DGGE和16S rRNA基因序列分析测定微生物总菌区系组成。结果发现,添加SBP和FOS降低培养液中粪臭素浓度和相对产率,而添加RYE和ALF的作用相反。ALF显著降低培养液中L-色氨酸的降解率。与对照组相比,纤维组总VFA和单个VFA（乙酸、丙酸、丁酸和戊酸）含量显著增加,pH显著降低。不同纤维组的DGGE图谱明显不同,但也有共同条带存在。SBP组DGGE图谱具有较高的多样性,出现了3条特异条带,其中2条带对应的最相似菌分别为Eubacterium rectale和Clostridium sp.。另外,有3条特异条带出现在SBP、RYE和ALF组中,其中2条带对应的最相似菌分别为Lachnospira pectinoschiza和Clostridium disporicum。结果提示,发酵模式的变化使L-色氨酸的降解率降低及主要降解产物向吲哚转变,这可能是粪臭素浓度降低的原因：而细菌C.disporicum可能与粪臭素的产生有关。第三部分：根据第二部分的试验结果选择两种对粪臭素生成有降低作用的纤维源进行在体动物试验,研究纤维源对猪肠道粪臭素产生、微生态及肝脏细胞色素P450基因表达的影响,包括3个试验。试验四研究饲喂肥育猪不同类型纤维后直肠粪臭素浓度和总菌区系组成的动态性变化。选择胎次相同、体重相近的杜×长×大三元杂交去势公猪18头（平均85kg）,随机分入对照组（CON）、甜菜组（SBP）和苜蓿组（ALF）,每组6头。对照组饲喂基础日粮,SBP和ALF组各添加20%的甜菜粕和苜蓿,调整日粮使其等蛋白。在试验第1、8、15、22和29天,每组选择4头猪采集直肠粪样用于吲哚类物质、VFA和微生物区系组成测定。结果发现,随着饲喂时间的延长,SBP和ALF组粪臭素浓度均先上升后降低。与CON相比,第15、22、29天后SBP组粪臭素浓度显著升高（P<0.05）,而ALF与CON没有显著差异。添加纤维对吲哚浓度无显著影响,而日粮因素对粪臭素浓度有显著影响（P<0.05）。第8、15、22和29天SBP组粪样中总VFA浓度升高,pH值降低（P<0.05）,第22天DGGE图谱条带数和相似性指数显著升高（P<0.05）。对SBP组第15、22和29天粪样总菌区系组成与粪臭素浓度的相关分析得出,来自Clostridiales和Lachnospiraceae的细菌可能与粪臭素的产生有关。试验五研究纤维源对猪不同肠段粪臭素和吲哚浓度的空间变化影响。试验动物和日粮同试验四,在试验结束后第33天,每组选择4头屠宰,采集Ce、PC、DC和Re肠道食糜用以粪臭素、吲哚、VFA浓度和微生物区系测定。结果发现,肠段因素对粪臭素的浓度有显著影响（P<0.05）,SBP和ALF组盲肠中粪臭素浓度最低。纤维源因素对粪臭素的浓度没有显著影响,但在盲肠SBP和ALF组粪臭素浓度降低。所有试验组总VFA含量从盲肠到直肠稳步降低,以SBP组最高。添加SBP能够增进结肠细胞凋亡（P<0.05）。不同日粮的DGGE图谱相似度较高,SBP组出现特异性的优势条带。经16S rRNA序列分析表明,结肠和直肠中亮度较高的2条条带所对应序列的最相似菌分别为Lactobacillus johnsoni和Lachnospiraceae,可能在粪臭素的产生中起作用。试验六研究纤维源对猪体不同组织、血浆中粪臭素水平和肝脏CYP2E1、CYP2A6基因表达的影响试验动物和日粮同试验四。试验结束后,每组选择4头猪进行屠宰,测定血液生化指标、胴体和肉质指标,并采集组织样品测定粪臭素和吲哚含量；用Real-time PCR测定肝脏CYP2E1和CYP2A6 mRNA表达丰度。结果发现,猪日粮中添加20%SBP和ALF对生长性能没有显著影响,显著降低平均背膘厚（P<0.05）。添加SBP升高背脂中粪臭素水平,而ALF组趋于降低（P=0.076）；SBP和ALF组猪肠脂中粪臭素含量均显著降低（P<0.05）,背脂、背肌、腹脂和肠脂中吲哚水平也有不同程度的降低。添加SBP显著提高CYP2E1mRNA表达,而ALFALF组的CYP2E1和CYP2A6 mRNA表达都显著升高（P<0.05）。SBP和ALF组CYP2E1和CYP2A6酶活均与CON没有显著差异。结果表明,适量添加ALF能够降低粪臭素水平,调控效果优于SBP,可以应用在猪日粮中。ALF降低粪臭素沉积的作用可能与CYP2E1和CYP2A6表达量的升高有关。综上所述,在达到性成熟前,猪体粪臭素水平随着年龄的增长而升高,与肝脏中CYP2E1和CYP2A6基因的表达无确定关系。猪肠段粪臭素浓度随着盲肠到直肠的延伸而增加,不同品种及不同肠段微生物区系组成差别较大,发酵模式亦不同。不同发酵类型的纤维物质对猪体粪臭素水平的作用不同,可能通过改变肠道微生物区系和发酵模式来影响粪臭素的产生,细菌C. aminophium、C. disporicum、L. johnsonii和Lachnospiraceae可能与粪臭素的生成有关。日粮中添加适量ALF能够降低猪体粪臭素水平,调控效果优于SBP,这为猪肉品质的改善提供了理论与实践依据。

论文目录

• 目录
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• 缩略词
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• Abstract
• 第一章 文献综述
• 第一节 猪体粪臭素的产生
• 1 粪臭素的生物合成
• 2 粪臭素的代谢途径
• 3 猪肉中粪臭素的发生率
• 4 粪臭素对养猪业的影响
• 第二节 影响猪体粪臭素水平的因素
• 1 年龄和体重
• 2 饲粮组成
• 3 遗传和品种
• 4 饲养环境和管理
• 5 激素水平
• 第三节 日粮纤维对猪体粪臭素沉积的调控
• 1 日粮纤维在养猪生产上的应用
• 2 日粮纤维对猪大肠微生物的影响
• 3 纤维物质对猪体内粪臭素沉积的影响
• 4 纤维物质影响猪体粪臭素沉积的机制
• 第四节 DGGE技术在动物肠道微生态研究中的应用
• 1 DGGE技术的基本原理
• 2 DGGE方法的工作流程
• 3 DGGE技术在动物胃肠道微生态研究中的应用
• 4 DGGE技术的优缺点
• 5 小结
• 第五节 本研究的目的意义和主要内容
• 1 本研究的目的意义
• 2 主要研究内容
• 第二章 猪体粪臭素沉积的时空变化规律研究
• 第一节 不同日龄猪体粪臭素水平与细胞色素P450基因表达
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 第二节 猪不同肠段粪臭素产生与微生物组成变化
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 纤维源对猪直肠菌群作用下L-色氨酸体外代谢的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 第四章 纤维源对猪肠道粪臭素产生、微生态及肝脏细胞色素P450基因表达的影响
• 第一节 纤维源对猪直肠粪臭素产生和微生物组成的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 第二节 纤维源对猪不同肠段粪臭素产生和微生态的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三节 纤维源对猪体粪臭素沉积和肝脏细胞色素P450基因表达的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 第五章 提示、创新点及后续研究展望
• 1 提示
• 2 创新点
• 3 后续研究展望
• 参考文献
• 博士期间发表论文
• 致谢