论文摘要
前言在我实验室完成国家自然基金资助项目《肠上皮淋巴细胞在消化道溃疡中生物活性的变化》和辽宁省科学技术基金项目((Ag85A基因疫苗治疗膀胱癌的研究》的基础上，已经建立了与iIEL研究相关的一整套实验技术，如iIEL及其亚群的分离技术，细胞因子检测技术，细胞毒及NK活性检测技术等。本实验为国家自然科学基金《自制口服DNA疫苗的黏膜表达部位与诱导肠iIEL效应机制的研究》中的一部分，拟采用构建的可在真核细胞内表达Ag85A基因的质粒，制成可供口服的DNA疫苗，经口服途径投与小鼠，以观察DNA疫苗对IEL的生物学活性的影响为重点，进行口服DNA疫苗的黏膜局部免疫应答效应的研究，阐明口服DNA疫苗诱导肠道局部黏膜免疫反应的机制。本实验将对口服DNA疫苗诱导肠道IEL的功能变化及黏膜局部免疫应答效应有较深入的了解，为调节肠道局部免疫功能提供新思路，并且将为口服DNA疫苗的临床应用进一步提供理论和实验依据。实验材料和方法按照Pure Yield Plasmid Maxiprep System质粒抽提试剂盒的说明从大肠杆菌中提取Ag85A质粒，然后用BglⅡ限制性内切酶消化质粒，经琼脂糖凝胶电泳鉴定Ag85ADNA的存在。C57BL／6小鼠30只，雄性，6—8周龄，体重18—22克，随机分成3组①生理盐水组10只，经口灌饲100μl生理盐水；②空质粒组10只，经口灌饲100μl lg／L以1：1-1：0.5的比例在室温状态下与脂质体乳化融合的空质粒；③Ag85A疫苗组10只，经口灌饲100μl lg／L Ag85A疫苗，共免疫三次，每次间隔14天，于末次免疫后的第10天颈脱位法处死各组小鼠，收集iIEL和脾细胞。用PE-cy5-CD3，FITC-CD4和PE-CD8荧光抗体标记，经流式细胞仪分析。同时用乳酸脱氢酶法测定脾NK细胞毒活性。实验结果以均数±标准差（（?）±s）表示，用t检验进行显著性分析。实验结果末次免疫后10天，Ag85A疫苗组和生理盐水组CD4-CD8+iIEL相比差异显著降低（P＜0.05），空质粒组和生理盐水组CD4+CD8-iIEL百分比相比无显著差异；Ag85A疫苗组，空质粒组和生理盐水组CD4-CD8+iIEL百分比无显著差异。Ag85A疫苗组和生理盐水组脾NK细胞毒活性见有意义的变化（P＜0.05）。结果显示口服Ag85A DNA疫苗后小鼠CD4-CD8+ iIEL百分比的数量显著降低，而脾NK细胞毒活性则增加。讨论本实验中小鼠在口服Ag85A DNA疫苗后出现了iIEL免疫功能下调和脾NK细胞毒活性提高，推测其机制可能如下，DNA疫苗的接种方法及途径将影响其所含目的基因的表达、抗原的提呈及其诱导的免疫应答的类型。Tanglle等曾用肌肉注射和皮内基因枪轰击方法将Ag85A DNA疫苗投于BALB／c小鼠和C57BL小鼠。结果发现，基因枪轰击方法可诱导BALB／c小鼠的抗体水平升高和CTL应答增强，但Th1型细胞因子IL-2和IFN-7分泌水平较低；而C57BL小鼠则对基因枪轰击方法反应较弱，对经肌肉注射接种反应较强，IL-2和IFN-γ分泌水平较BALB／c小鼠明显升高。另外经口免疫耐受与粘膜相关淋巴组织关系密切，一般来说低剂量口服抗原通过主动抑制起作用，高剂量抗原诱导克隆缺失和克隆无能。口服抗原作用于GALT中的调节性CD4+T细胞，诱导其分泌抑制性细胞因子，如Th2或Th3类细胞因子来诱导免疫抑制。Tsuji等给予BALB／C小鼠口服β-乳球蛋白后发现，小肠PP淋巴结中出现抗原特异性CD4+CD25+调节性细胞克隆，这些克隆具有无能的特性，且能主动抑制β-乳球蛋白特异性抗体的产生。激活的CD8+γdT细胞除本身可以分泌TGF-β、IL-10等抑制因子外，还可以促使CD4+aβT效应细胞向Th2／Th3表型转化，并使得TGF-β、IL-4、IL-10等细胞因子的分泌增加，进而发挥免疫抑制作用。CD8+T细胞也表达抑制性表型，与肠上皮细胞共同培养后，CD8+Tr细胞可进行寡克隆扩增，而这些细胞在炎症性肠道疾病患者中是缺失的，这表明CD8+T细胞也参与了免疫耐受。结论1、口服Ag85ADNA疫苗后小鼠CD4-CD8+iIEL百分比明显降低，CD4+CD8-ilEL百分比未见明显变化。2、口服Ag85ADNA疫苗后小鼠脾NK细胞毒活性明显提高。