中国荷斯坦牛c-Jun和c-Fos基因SNPs与奶牛耐热性状、泌乳性状的关联分析

论文摘要

我国南方地区夏季高温时间较长,热应激一直是困扰奶牛生产的主要问题之一。当奶牛发生热应激时,奶牛的生产性能、奶产品品质下降、免疫系统紊乱,使其更易受微生物及疾病的侵袭；同时还会导致奶牛受胎率下降、流产率升高,使养殖场蒙受相当大的经济损失。因此,确定热应激的分子调控网络及其可能的作用机理,可为开发相关基因及其分子标记、选育耐热高产优质奶牛提供理论依据和技术支持。本试验以60头浙江省金华市伊康乳业奶牛场内中国荷斯坦牛为研究对象,分析了在热应激与非热应激状态下中国荷斯坦牛泌乳中、后期外周血的牛全基因组表达谱的变化情况。通过对热应激与非热应激状态下前后差异基因的KEGG通路分析,选取MAPKs信号通路中两倍上调或下调差异表达基因作为奶牛耐热性能相关的候选基因。同时,选取140头处于泌乳前期的中国荷斯坦牛（其中57头有生产数据）,测试并分析了在非热应激期（15℃）、临界期（26℃）和热应激期（37℃）的直肠温度、血常规和血清生化指标的变化情况,进行了c-Jun和c-Fos基因的SNPs与上述指标和生产性能的之间的关联分析,初步分析了c-Jun.c-Fos基因用于中国荷斯坦牛热应激分子标记辅助育种的可行性。结果如下：1.泌乳中、后期的中国荷斯坦牛在热应激和非热应激状态下外周血牛全基因组表达谱芯片结果显示,不同时期基因的检测数及检测率为泌乳早期15007/62.20%,热应激下泌乳中期14308/59.30%,泌乳后期15241/63.20%,热应激下泌乳后期14734/61.10%。泌乳中、后期在热应激和非热应激状态下分别上调16个,下调26个基因。2.泌乳中、后期的中国荷斯坦牛在热应激和非热应激状态下外周血的牛全基因组表达谱中2倍上调或下调的差异表达基因进行KEGG通路分析后,选取MAPKs信号通路进一步分析,发现该通路中2倍上调或下调的差异表达基因——p53.c-Jun.c-Fos. TGFBR2.PRKACA.PRKACB.IL1B和GADD45A,涉及蛋白结合、受体活性、转录因子活性、丝/苏氨酸蛋白激酶活性和蛋白激酶活性等多种分子功能。3.对非热应激期（15℃）、临界期（26℃）和热应激期（37℃）中国荷斯坦牛外周血血常规的测定表明,中国荷斯坦牛外周血液在温度15℃时,血红蛋白、红细胞压积、平均血红蛋白含量、红细胞体积分布宽度、血小板计数、血小板压积和平均血小板体积与上述指标在温度为26℃时期和37℃时期差异极显著变化（P<0.01）,其中红细胞压积26℃时期与37℃时期差异显著下降（P<0.05）、平均血红蛋白浓度在26℃时期与37℃时期极显著（P<0.01）上升。其余指标在26℃时期和37℃时期比较差异不显著（P>0.05）。平均红细胞体积在三个温度下均不显著（P>0.05）。4.中国荷斯坦牛直肠温度随环境温度的提高也逐渐增加,热应激期（37℃）和热应激临界期（26℃）的中国荷斯坦牛直肠温度极显著高于非热应激期（15℃）（JF）<0.01),热应激期（37℃）虽较热应激临界期（26℃）有所增加,但二者间差异不显著（P>0.05）。5.中国荷斯坦牛外周血血清中谷胱甘肽过氧化物酶含量和总抗氧化能力均随环境温度的提高极显著地降低。其中各个时期间的谷胱甘肽过氧化物酶含量均存在极显著的差异（P<0.01）；热应激期（37℃）和热应激临界期（26℃）中国荷斯坦牛外周血血清中总抗氧化能力极显著低于非热应激期（15℃）（P<0.01）,热应激期（37℃）总抗氧化能力极显著低于热应激临界期（26℃）（P<0.05）。6.以中国荷斯坦牛基因组DNA为模板,对基因芯片筛选出MAPKs信号通路中差异基因进行SNPs的检测。结果发现,c-Jun和c-Fos基因在试验群体中检测到中度多态的SNPs,并且与部分血常规、直肠温度及血清生化指标和泌乳性状的关联分析。SNP c-Jun p1与部分血常规的关联分析结果表明,各基因型对部分血常规指标无显著性影响（P>0.05）。SNP c-FosP5与部分血常规的关联分析结果表明,SNP c-FosP5与红细胞计数间存在显著关联（P<0.05）, AA型的红细胞计数值显著高于GG型（P<0.05）,呈现出AA>AG>GG的趋势。SNP c-Jun P1与直肠温度及血清生化指标的关联分析结果表明,仅发现SNP c-Jun p1杂合型在热应激期（37℃）总抗氧化能力显著高于G缺失纯合型（P<0.05）,呈现出G—>GG>——的趋势。SNP c-Fos P5与直肠温度及血清生化指标的关联分析结果表明,SNP c-Fos P5与热应激期（37-C）的谷胱甘肽过氧化物酶酶活显著相关,其中AA型在热应激期（37℃）谷胱甘肽过氧化物酶酶活显著低于GG型（P<0.05）,呈现出AA<AG<GG的趋势。SNP c-Jun P1与泌乳性状的关联分析结果表明,SNP c-Jun P1与乳脂率存在显著关联（P<0.05）,GG型显著高于G—型（P<0.05）。对305天产奶量、305天乳脂量、305天乳蛋白量、乳蛋白率和体细胞计数无显著性影响（P>0.05）。SNP c-Fos P5与泌乳性状的关联分析结果表明,AA型对乳脂率极显著高于AG型（P<0.01）。对305天产奶量、305天乳脂量、305天乳蛋白量、乳蛋白率和体细胞计数无显著性影响（P>0.05）。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩写说明
• 第一章 文献综述
• 1. 热应激对奶牛生产的影响
• 1.1 对奶牛繁殖性能的影响
• 1.2 对奶牛免疫性能的影响
• 1.3 对产奶量及乳品质的影响
• 2. 丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases,MAPKs）信号通路及与热应激反应的关系
• 2.1. 丝裂原活化蛋白激酶信号通路
• 2.2 丝裂原活化蛋白激酶信号通路与热应激的关系
• 2.3 小结
• 3. AP-1转录因子简要概述
• 3.1 AP-1的结构和功能
• 3.2 AP-1的生物学功能
• 3.3 AP-1家族成员c-Jun和c-Fos的研究进展
• 4. 基因芯片技术研究现状
• 4.1 基因芯片简介
• 4.2 基因芯片在畜牧业中的应用
• 4.3 小结
• 5. 研究目的和意义
• 第二章 中国荷斯坦牛全基因组表达谱芯片检测与数据分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验动物与采样方法
• 1.2 主要仪器设备及仪器
• 1.3 主要试剂
• 1.4 芯片的制备及数据分析
• 2 结果
• 2.1 试验样品总RNA的检测
• 2.2 cDNA芯片的原始灰度图
• 2.3 芯片杂交结果
• 2.4 基因芯片检测不同泌乳时期热应激前后的差异表达基因分析
• 3 讨论
• 3.1 试验设计
• 3.2 MAPKs信号通路中主要差异表达基因的功能分析
• 第三章 热应激对中国荷斯坦牛外周血部分血常规的影响
• 1. 材料与方法
• 1.1 试验动物
• 1.2 血液样本采集
• 1.3 测定方法
• 1.4 数据处理
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 第四章 热应激对中国荷斯坦牛血液生化指标的影响
• 1. 材料与方法
• 1.1 试验动物
• 1.2 血液样本采集
• 1.3 测定方法
• 1.4 数据处理
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 3.1 热应激对中国荷斯坦牛直肠温度的影响
• 3.2 热应激对中国荷斯坦牛GSH-PX的影响
• 3.3 热应激对中国荷斯坦牛T-AOC的影响
• 第五章 中国荷斯坦牛c-Jun基因、c-Fos基因单核苷酸多态性与血常规、血清生化指标和泌乳性状的关联分析
• 1. 材料与方法
• 1.1 试验动物及采样方法
• 1.2 DNA提取
• 1.3 PCR扩增及检测
• 2. 结果
• 2.1 中国荷斯坦牛全基因组提取结果
• 2.2 p53、TGFBR2、PRKACA、PRKACB、IL1B、GADD45A的PCR-SSCP
• 2.3 c-Jun基因PCR-SSCP分析
• 2.4 c-Fos基因PCR-SSCP分析
• 2.5 SNPs的群体遗传学分析
• c-Jum P1和SNP_{c-Fos P5}与血常规、血清生化指标和泌乳性状的关联分析'>2.6 SNP_{c-Jum P1}和SNP_{c-Fos P5}与血常规、血清生化指标和泌乳性状的关联分析
• 3. 讨论
• 3.1 中国荷斯坦牛试验群体c-Jun、c-Fos基因SNPs分析
• 3.2 中国荷斯坦牛试验群体c-Jun、c-Fos基因SNPs分析
• c-Jun P1、SNP_{c-Fos P5}与血常规、血清生化指标及泌乳性状的关联分析'>3.3 中国荷斯坦牛试验群体SNP_{c-Jun P1}、SNP_{c-Fos P5}与血常规、血清生化指标及泌乳性状的关联分析
• 全文总结、创新点及后续研究
• 1. 全文总结
• 2. 创新点
• 3. 后续研究
• 参考文献
• 附录
• 附录1 泌乳中、后期的中国荷斯坦牛在热应激和非热应激状态下外周血差异表达基因KEGG通路分析
• 附录2 MAPKs信号通路中差异表达基因参与的生物学过程
• 附录3 MAPKs信号通路中差异表达基因参与的细胞组成
• 附录4 热应激期c-Jun基因与部分血常规、直肠温度和血清生化指标关联分析
• 附录5 热应激期c-Fos基因与部分血常规、直肠温度和血清生化指标关联分析
• 致谢
• 在读学位期间发表论文