大鼠胸髓半横断后腰髓前角的突触可塑性研究

论文摘要

第一部分大鼠胸髓半横断后后肢运动功能自发性恢复目的:通过斜板实验、Tarlov评分和BBB评分方法相结合进行脊髓损伤后运动功能综合评价来研究胸髓半横断后后肢运动功能恢复程度。方法:66只成年健康SD大鼠随机分为实验组、假手术组和正常对照组。实验组和假手术组按术后存活期分为12h、3d、7d、14d和21d亚组。实验组动物在T10处横断右侧半脊髓,假手术组大鼠在相同部位只进行椎板切除,正常对照组不做任何处理。在各存活时间点通过斜板实验、Tarlov评分和BBB评分综合评价胸髓半横断后后肢运动功能。结果:大鼠胸髓半横断后12h时,后肢运动功能完全丧失,斜板实验、Tarlov评分和BBB评分这三种评分急剧下降（p＜0.05）,从3d开始,后肢功能逐渐恢复,评分结果增加,至21d时斜板实验、Tarlov评分和BBB评分这三种评分与正常接近,运动功能基本恢复正常。结论:大鼠胸髓半横断后后肢运动功能出现自发性恢复。第二部分大鼠胸髓半横断后腰髓前角的突触可塑性变化目的:在第一部分观察到有后肢运动功能自发性恢复的基础上,通过检测胸髓半横断后腰髓突触囊泡素（synaptophysin,SYN）的表达变化,研究腰髓前角运动神经元和中间神经元的突触可塑性变化。方法:实验分组和动物模型与第一部分相同。实验动物在处死前5天经坐骨神经注射荧光金（fluorogold,FG）,通过SYN免疫荧光反应检测腰髓（L5）节段运动神经元周围的突触囊泡素的表达变化,用维生素D依赖性钙结合蛋白（Calbindin D28k,CB）或钙网蛋白（Calretinin,CR）和SYN免疫荧光双标方法检测L5节段中间神经元周围的SYN的表达变化。另取实验动物（n=66）用Western Blot方法检测L5节段SYN蛋白表达改变。并对后肢运动功能BBB评分与腰髓损伤侧SYN蛋白表达、前角运动神经元和中间神经元周围的SYN表达水平进行相关分析和回归分析。结果:胸髓半横断后,腰髓运动神经元和中间神经元周围的SYN表达呈现损伤早期减少后期增加的趋势:损伤后12h时CR-ir神经元周围的SYN-ir降低,3d时恢复至正常水平。CB-ir神经元周围的SYN表达在损伤后3d时才开始下降。而运动神经元周围的SYN表达在损伤后12h时下降,3d才开始轻微回复,然后维持其表达水平,至21d才增加至稍高于正常,在时相上明显晚于中间神经元的改变。Western blot结果显示腰髓损伤侧SYN蛋白表达早期没有明显变化,直至21d才增加。相关分析显示后肢运动功能BBB评分与腰髓损伤侧SYN蛋白表达总量之间r=0.42（p=0.003）,BBB评分与运动神经元周围的SYN表达水平之间r=0.33（p=0.02）,BBB评分与CR-ir神经元周围的SYN表达水平之间r=0.45（p=0.001）;而回归分析显示BBB评分有20%的可能是由腰髓SYN蛋白表达总量（r2=0.20）或15%的可能是由运动神经元周围的SYN表达变化引起（r2=0.15）或19%的可能是由CR-ir神经元周围的SYN表达变化引起（r2=0.19）。提示后肢运动功能BBB评分与腰髓损伤侧SYN蛋白表达总量和CR-ir神经元周围的SYN表达水平之间呈正相关。结论:胸髓半横断后腰髓运动神经元和中间神经元出现突触可塑性改变,这些改变具有时相特征,而且后肢运动功能恢复与腰髓损伤侧SYN蛋白表达或运动神经元或CR-ir中间神经元的可塑性改变呈正相关。第三部分大鼠胸髓半横断后腰髓可塑性变化的可能机制目的:研究大鼠胸髓半横断后运动神经元和中间神经元突触可塑性变化的可能机制。方法:54只SD大鼠随机分为实验组、假手术组和正常对照组。实验组动物行T10脊髓节段右侧半横断。假手术组动物仅行相同部位的椎板切除术。正常对照组不做任何处理。三组动物均于第7d分别在左侧、右侧运动皮质后肢区或C4双侧灰质区进行生物素葡聚糖胺（biotinylated dextran,BDA）顺行示踪,第21d时处死,通过BDA顺行示踪和CR/小白蛋白（parvalbumin,PV）/SYN免疫荧光双标检测颈髓（C5）节段的BDA阳性产物与CR/PV-ir神经元的关系以及L5节段的BDA阳性产物与SYN免疫阳性产物或CR/PV-ir神经元的关系。结果:胸髓半横断后21d时颈髓双侧可见BDA标记的皮质脊髓束侧枝增加,并且这些侧枝与CR/PV-ir的中间神经元形成联系;同时腰髓损伤侧还可观察到BDA标记的长脊髓固有束神经元（longpropriospinal neuron,LPN）轴突与SYN双标,并与CR/PV-ir的中间神经元形成联系。结论:胸髓半横断后21d时受损和未受损的皮质脊髓束发出侧枝经颈髓中间神经元中继或直接经LPN轴突与腰髓的中间神经元和运动神经元建立联系,这种新的环路的建立可能是大鼠胸髓半横断后运动功能恢复的形态学依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词
• 前言
• 第一部分 大鼠胸髓半横断后后肢运动功能自发性恢复
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 动物模型制备
• 1.1.2 神经功能评价标准
• 1.1.3 结果观察与分析
• 1.2 结果
• 1.2.1 神经功能检测
• 1.3 讨论
• 第二部分 大鼠胸髓半横断后腰髓前角的突触可塑性变化
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 动物模型制备
• 2.1.2 坐骨神经FG逆行示踪
• 2.1.3 组织制备
• 2.1.4 腰髓SYN免疫荧光染色
• 2.1.5 腰髓CB/CR与SYN免疫荧光双标染色
• 2.1.6 蛋白质免疫印迹（Western blot）
• 2.1.7 结果观察与分析
• 2.2 结果
• 2.2.1 胸髓半横断后腰髓损伤侧FG标记的运动神经元数目变化
• 2.2.2 胸髓半横断后腰髓损伤侧FG标记的运动神经元和CB/CR-ir神经元周围的SYN表达变化
• 2.2.3 胸髓半横断后腰髓SYN蛋白表达变化
• 2.2.4 胸髓半横断后后肢运动功能检测BBB评分与腰髓SYN蛋白表达以及损伤侧CB-ir神经元、CR-ir神经元和FG标记的运动神经元周围的SYN-ir的相关性分析
• 2.3 讨论
• 2.3.1 胸髓半横断后腰髓损伤侧运动神经元和中间神经元的突触可塑性变化
• 2.3.2 胸髓半横断后后肢运动功能恢复与腰髓的突触可塑性改变的关系
• 第三部分 大鼠胸髓半横断后腰髓可塑性变化的可能机制
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 动物模型制备和实验分组
• 3.1.2 BDA皮质脊髓束顺行示踪
• 3.1.3 BDA颈膨大长脊髓固有束神经元顺行示踪
• 3.1.4 组织制备
• 3.1.5 颈髓和腰髓BDA显色与CR/PV/SYN免疫荧光双标
• 3.1.6 结果观察与分析
• 3.2 结果
• 3.2.1 颈髓后索BDA标记的CST轴突分布变化
• 3.2.2 颈髓BDA标记的CST侧枝及其与CR-ir和PV-ir神经元联系的变化
• 3.2.3 腰髓前角损伤侧BDA标记LPN轴突与SYN双标
• 3.2.4 腰髓前角损伤侧中BDA标记的LPN轴突与CR/PV-ir神经元联系的变化
• 3.3 讨论
• 参考文献
• 结论
• 综述
• 致谢
• 攻读学位期间主要的研究成果