胶体金免疫层析方法快速检测食品中氯霉素的残留研究

论文摘要

目的:氯霉素作为一种高效广谱的抗生素,广泛用于动物各种传染性疾病的治疗,但是因其毒副作用较强,许多国家和地区相继禁止或严格限制使用氯霉素,传统的氯霉素残留分析方法需要昂贵的仪器和专业技术人员,且周期长、成本高,不能满足现场和快速检测的要求。因此,建立高效、灵敏、经济的氯霉素残留分析方法是很有必要的。胶体金免疫层析试纸条检测法是利用抗原和抗体的特异性结合反应对微量抗原或抗体进行测定的方法,本论文旨在研制氯霉素免疫胶体金层析试纸条,应用于畜产品中氯霉素残留的快速检测,具有重要的现实意义和极高的商业开发价值。方法:通过体外扩大培养杂交瘤细胞,将细胞接种到小鼠体内,采用体内诱生法制备出含抗氯霉素特异性单克隆抗体的腹水。腹水经辛酸-硫酸铵法、亲和柱层析法进行纯化。纯化后用全抗原对三株单抗从蛋白浓度、效价以及交叉反应等指标进行质量鉴定;采用柠檬酸三钠还原法制备了不同粒径的胶体金,将具有氯霉素特异性的免疫胶体金均匀灌注在BT50型玻璃纤维膜,烘干后即为胶体金垫。经比较试验选用Whatman公司的AE98Fast硝酸纤维素膜作为层析膜;控制线采用20倍稀释的羊抗鼠IgG;用浓度为1mg/mL的氯霉素包被原（CAP-BSA）喷涂检测线,最后组装成试纸条。结果:选取4D10作为制备探针抗体,其蛋白浓度为2.89mg/mL,经ELISA法测定抗体效价为1:1.024×106,利用改良竞争ELISA法测定单抗与各抗生素的交叉反应,抗氯霉素单克隆抗体（CAP-McAb）与氯霉素琥珀酸钠有交叉反应而与青霉素、链霉素、磺胺二甲嘧啶、甲砜霉素等抗生素无交叉反应,与各抗生素、类似物的交叉率均小于0.01%,具有较高的特异性和亲和力。通过紫外分析和外观观察试验确定了胶体金标记抗体的最适蛋白质浓度为48μg/mL,最适pH在8.2左右。用制得的免疫层析试纸条检测已知的含有氯霉素的样品,灵敏度为100ng/mL,在其灵敏度范围内重现性为100%,试纸条在5min左右出现清晰的条带。结论:对制备的氯霉素的免疫胶体金层析试纸条的验证试验表明,该试纸条检测时间短,稳定性良好,符合快速检测要求,对氯霉素的特异性强、操作简单、快速,初步为现场批量检测氯霉素残留奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 序言
• 1. 氯霉素残留检测研究发展
• 1.1 氯霉素及其作用机制
• 1.2 氯霉素残留及其限量标准
• 1.3 氯霉素残留的检测方法
• 2. 胶体金免疫层析技术及其应用
• 2.1 胶体金技术的原理
• 2.2 胶体金技术的应用
• 2.3 胶体金免疫层析技术的优点
• 2.4 发展方向
• 第一部分 氯霉素单克隆抗体的制备、鉴定
• 1. 材料与方法
• 1.1 试验动物
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器与器材
• 1.4 溶液系统
• 1.5 杂交瘤细胞的复苏
• 1.6 体内诱生法大量制备单克隆抗体
• 1.7 抗氯霉素单克隆抗体的纯化
• 1.8 氯霉素单克隆抗体纯化结果鉴定
• 1.9 间接ELISA 测定提纯后抗体的效价
• 1.10 单抗与各抗生素、类似物的交叉反应
• 2. 结果与分析
• 2.1 单克隆抗体分子量与纯度、浓度鉴定
• 2.2 单克隆抗体效价确定
• 2.3 单抗与各抗生素类似物的交叉反应
• 3. 讨论
• 3.1 关于氯霉素单抗的制备及纯化
• 3.2 关于氯霉素单抗的交叉反应性
• 3.3 抗体的选择
• 第二部分 胶体金免疫层析试纸条的制备
• 1. 材料与方法
• 1.1 试剂
• 1.2 仪器与耗材
• 1.3 溶液的配制
• 1.4 胶体金的制备
• 1.5 胶体金标记蛋白抗体
• 1.6 金标单抗吸附于玻璃纤维
• 1.7 试纸条组装材料的选择
• 1.8 试纸条的性能测定
• 2. 结果与分析
• 2.1 胶体金的制备
• 2.2 胶体金标记抗体蛋白
• 2.3 探针活性的鉴定
• 2.4 金标结合垫的封闭条件
• 2.5 金标稀释条件的选择
• 2.6 T 线浓度的确定
• 2.7 层析材料的选择
• 2.8 试纸条的性能测定
• 3 讨论
• 3.1 胶体金溶液的制备
• 3.2 金标抗体的制备和纯化
• 3.3 金标单抗吸附于玻璃纤维
• 3.4 硝酸纤维素膜的选择和处理
• 3.5 试纸条的性能测定
• 3.6 试纸条的特点及改进方向
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的论文
• 附录 英文缩略词表
• 致谢