家猫血管紧张素转换酶2基因的cDNA克隆、表达、生物信息学分析及其组织分布研究

论文摘要

血管紧张素转换酶2（angiotensin-converting enzyme 2,ACE2）是一种金属蛋白酶,它广泛存在于人及动物的心脏、肝脏、肺脏、肾脏、睾丸以及肠道等主要器官中,在调节心脏、肾脏功能及控制血压中起到非常关键的作用,也有研究报道ACE2基因参与糖尿病肾病的病理发展,同时在睾丸组织的特异性表达被认为可能也参与了生殖能力的调节。最近发现,ACE2是严重急性呼吸系统综合症冠状病毒（severe acute respiratory syndrome associated coronavirus,SARS-CoV）的功能性受体。 SARS-CoV的纤突（Spike,S）蛋白能特异识别靶细胞上的ACE2蛋白并与之结合,从而介导病毒侵入靶细胞。业已发现除了人以外,恒河猴、果子狸、家猫、雪貂都是SARS-CoV的易感动物,小鼠、大鼠、果子狸等动物的ACE2同样能介导SARS-CoV感染细胞。有研究表明,多种Ⅰ和Ⅲ型冠状病毒都能够利用家猫中的特异受体从而侵入靶细胞。这些现象都说明家猫有可能在冠状病毒跨种感染以及新冠状病毒的衍生过程中起到重要作用。ACE2蛋白是2000年才鉴定出来的一种新蛋白,对其功能结构还缺乏彻底了解。目前仅对人、小鼠ACE2蛋白有深入研究,对家猫ACE2的研究仍属空白。 本研究克隆并表达了家猫ACE2基因,并对其编码蛋白的理化性质、功能结构进行分析和预测。通过RT-PCR方法检测了ACE2在各主要组织器官中的表达情况,并对部分基因进行了表达研究,具体研究内容如下: 根据已经报道的人及小鼠的ACE2基因mRNAm列设计引物,从家猫肺脏总RNA中分段扩增出家猫ACE2基因mRNA编码区序列。序列分析结果表明,家猫ACE2基因mRNA编码区序列长2418 bp,所编码的蛋白含805个氨基酸残基。经序列比较发现,家猫ACE2基因mRNA编码区序列与人、小鼠及大鼠ACE2基因mRNA编码区序列的同源性分别为86%、84%和84%,氨基酸同源性分别为85%、81%和81%。 利用生物信息学方法对家猫ACE2蛋白的物理化学性质、信号肽、跨膜螺旋、蛋白质二级结构、蛋白质结构域、基序以及蛋白质家族进行预测,同时综合各工具的预测结果对家猫ACE2蛋白的各方面性质进行了分析。与其它几种动物的ACE2相比,猫ACE2的SARS-CoV结合功能区氨基酸与人的同源性最高,提示猫可能在SARS-CoV的传播中起重要作用。 通过RT-PCR方法,检测家猫各组织器官中ACE2蛋白的表达分布,证实家猫主要组织器官中ACE2的表达分布与已经报道的人体分布情况一致。 通过对信号肽、跨膜螺旋的预测,再设计了一对引物特异性扩增信号肽与跨膜螺旋之间的片段。进一步构建原核表达质粒pET-ACE2,在大肠杆菌BL21（DE3）plysS中实现了表达,融合蛋白分子量约为85kD。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 文献综述
• 1.1.1 严重急性呼吸系统综合症的流行病学及其危害
• 1.1.2 SARS-CoV的形态和结构
• 1.1.3 SARS-CoV的基因组结构
• 1.1.4 SARS-CoV的增殖周期
• 1.1.5 SARS-CoV编码的主要蛋白
• 1.1.6 SARS-CoV的受体
• 1.2 目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验动物及细胞
• 2.1.2 质粒及菌株
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 工具酶及试剂盒
• 2.1.5 其它相关试剂
• 2.1.6 主要溶液
• 2.2 方法
• 2.2.1 样品总 RNA的提取
• 2.2.2 样品总 RNA的纯化
• 2.2.3 家猫 ACE2基因mRNA编码区序列的扩增
• 2.2.4 PCR产物的克隆
• 2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.6 连接产物的转化
• 2.2.7 质粒的少量制备（碱裂解法）
• 2.2.8 DNA胶快速回收试剂盒的使用
• 2.2.9 DNA重组技术（DNA酶切、连接）
• 2.2.10 序列测定
• 2.2.11 生物信息学分析
• 2.2.12 家猫 ACE2组织分布 RT-PCR
• 2.2.13 家猫 ACE2基因用于原核表达片段的 PCR扩增
• 2.2.14 大肠杆菌 BL21（DE3） plysS的表达诱导与样本处理
• 2.2.15 SDS-PAGE电泳
• 2.2.16 Western blot
• 3 结果与分析
• 3.1 家猫 ACE2基因mRNA编码区序列的测定及序列比较
• 3.2 家猫 ACE2蛋白的生物信息学分析
• 3.2.1 家猫 ACE2基因编码蛋白结构及理化性质分析
• 3.2.2 家猫 ACE2基因编码蛋白的功能预测
• 3.3 家猫 ACE2表达组织分布
• 3.4 家猫 ACE2基因原核表达质粒的构建与鉴定
• 3.5 家猫 ACE2基因在 BL21（DE3） plysS中的表达
• 3.6 家猫 ACE2基因原核表达产物活性检测
• 4 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 附录