灰红链霉菌AL7异源表达文库的构建及功能基因的筛选

论文摘要

链霉菌是重要的抗生素产生菌。灰红链霉菌AL7是自湖北神农架地区土壤样品中分离到的,对很多植物病原菌和细菌具有很好的生物活性,所产抗生素类型目前尚未鉴定。抗生素等次级代谢的研究需要借助大肠杆菌菌株进行基因克隆,并通过特殊菌株介导属间接合转移以便开展基因中断或基因簇异源表达等研究。目前没有同时兼备上述功能的大肠杆菌菌株。本研究在cosmid文库常用宿主XL1-blue MR的基础上,敲除了甲基化基因dcm,得到甲基化缺陷的非限制型大肠杆菌XL1-blue MRAdcm。灰红链霉菌AL7进行全基因组扫描,覆盖基因组20倍的扫描结果显示,灰红链霉菌AL7全基因组有9.9 Mb, largecontig有197个,其中最大的为contig00171大小为464 kb。全基因组中PKS基因有16个,NRPS基因有2个,萜烯基因有1个。而contig00171中同时含有1个PKS、1个NRPS和1个萜烯基因。本研究中采用多轮脉冲电泳回收外源DNA,得到了平均插入片段大小为40 kb的高质量的cosmid基因组文库。文库宿主是LP3,是转入了辅助质粒pUZ8002的XL1-blue MR△dcm。通过高通量接合转移的方法将文库转移到变铅青链霉菌TK24中进行异源表达,得到灰红链霉菌AL7的表达文库。表达文库分别在MS、R5和NA培养基上进行固体发酵,用红酵母、耻垢分枝杆菌和天蓝色链霉菌M600作指示菌进行大批量生物活性测定。初筛得到的克隆经重复验证确定了52个,将筛选到的这52个cosmid进行末端测序,测序结果与灰红链霉菌AL7全基因组扫描的序列相比对。这52个cosmid并不完全在同一个contig里,位于contig00171中的有3个cosmid。更换宿主验证其生物活性的稳定性,并根据基因注释,分析可能引起抑菌活性的相关基因。本研究中高质量基因组文库的高通量异源表达的应用,为大规模筛选基因簇和次级代谢产物等研究提供了一种有效的模型。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 1 文献综述
• 1.1 灰红链霉菌简介
• 1.2 初级代谢与次级代谢
• 1.3 化合物的筛选策略
• 1.4 微生物基因组文库的构建方法
• 1.5 基于基因组文库的次级代谢产物的克隆方法
• 1.6 异源表达理想的宿主
• 1.7 微生物限制修饰系统
• 1.7.1 大肠杆菌中的甲基化系统
• 1.7.2 链霉菌中的限制系统
• 1.7.3 原生质体转化和接合转移
• 1.8 接合转移供体大肠杆菌
• 1.9 本研究的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 菌株
• 2.2 质粒
• 2.3 引物
• 2.4 培养基和生化试剂
• 2.5 实验方法
• 2.5.1 链霉菌培养及菌种保藏
• 2.5.2 大肠杆菌质粒DNA的小量提取方法
• 2.5.3 大肠杆菌质粒DNA的少量快速提取及检测
• 2.5.4 链霉菌总DNA的大量提取方法
• 2.5.5 苯酚/氯仿纯化DNA的方法
• 2.5.6 聚合酶链式反应PCR及TA克隆
• 2.5.7 DNA片段的回收
• 2.5.8 DNA的酶切反应
• 2.5.9 DNA的去磷酸化处理
• 2.5.10 DNA的连接反应
• 2感受态的制备及转化'>2.5.11 大肠杆菌CaCl₂感受态的制备及转化
• 2.5.12 大肠杆菌电转化感受态的制备及电转化
• 2.5.13 大肠杆菌和链霉菌的两亲本属间的接合转移
• 2.5.14 Cosmid基因组文库的构建
• 2.5.15 Cosmid文库高通量接合转移
• 2.5.16 大批量生物活性测定
• 3 结果与分析
• 3.1 构建灰红链霉菌AL7 cosmid基因组文库的大肠杆菌宿主
• 3.2 构建高质量的灰红链霉菌AL7 cosmid基因组文库
• 3.3 大质粒在表达宿主中的完整表达率
• 3.4 构建异源表达文库
• 3.5 生物活性测定筛选表达文库
• 3.6 全基因组扫描注释
• 3.7 阳性cosmid末端测序定位
• 3.8 生物活性表型验证
• 4 总结
• 4.1 多轮脉冲电泳回收法构建高质量的cosmid基因组文库
• 4.2 高通量异源表达方法的成功应用
• 5 讨论
• 5.1 大肠杆菌LP3的优点与不足
• 5.2 高通量异源表达宿主的选择
• 5.3 研究展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文