棉花GhCNGC2基因的克隆与功能鉴定和夏威夷海洋海绵的真菌多样性分析

论文摘要

第一部分棉花环化核苷酸调节的离子通道基因GhCNGC2的克隆和功能鉴定高等植物的生长和发育需要吸收大量的营养物质和离子,它们对植物的信号转导,渗透调节以及代谢都是至关重要的。因此,植物对营养物质吸收的调节成为一种影响植物内部营养平衡的重要机制。近年来,作为一种重要的离子吸收机制,植物细胞对于营养离子的单方向吸收运输引起了越来越多研究者的兴趣,但早期的一些研究却主要集中在那些高选择性的离子通道上。然而最近的研究表明,植物对离子的吸收很大程度上是依靠一些非选择性阳离子离子通道（non-selective cation channel, NSCC）来实现的。通常来说,这类离子通道对阳离子具有很高的透过性,却完全不能传导阴离子;它们对于一价的阳离子具有广泛的渗透性,有时也可以传导一些二价的阳离子。环化核苷酸调节的离子通道（cyclic nucleotide-gated cation channel, CNGC）就是一种非选择性的阳离子通道。环化核苷酸调节的离子通道蛋白是一种在动、植物中广泛存在的非选择性的阳离子通道。在动物中,CNGC是一种受环化核苷酸（cNMP）调节的视觉和嗅觉的传感器;在植物中,有关CNGC的研究还相对较少,只是在拟南芥（Arabidopsis thaliana）、大麦（Hordeum vulgare）和烟草（Nicotiana tabacum）中有过少量的研究报道,因此对它们功能的了解还是非常有限,通常认为它们与植物的离子传递以及抗病性有关。棉花是一种纤维用经济作物,它具有广泛的应用价值和研究价值。本文以耐盐棉花品种中棉19（ZM19）为试验材料,构建了盐诱导的棉花幼苗叶片cDNA文库,并通过反向northern差异筛选法从中分离得到了一个与盐胁迫相关的克隆GhCNGC2。通过序列比对发现,该基因可能编码一种环化核苷酸调节的离子通道蛋白,并对该基因的功能和分子机制进行了探索。主要结果如下:1.利用Clontech SmartTM cDNA Library Construction Kit构建盐胁迫诱导的棉花幼苗叶片cDNA文库,通过反向northern差异筛选法获得一个与盐胁迫相关,长度为670 bp的克隆。设计特异引物,通过5’-RACE和3’-RACE PCR,克隆得到该基因的5’片段和3’片段,根据重叠片段进行拼接,再用特异引物扩增得到2388 bp的全长cDNA,其编码区全长为2145 bp,编码一个715个氨基酸的蛋白,推测其分子量为78 kDa。2.通过对该基因编码的蛋白同源性比较发现,该蛋白与植物的CNGCs家族具有较高的同源性,其中与拟南芥的AtCNGC2的蛋白同源性达到74.90%。聚类分析也表明,该基因编码的蛋白与拟南芥、水稻、大麦以及烟草中的CNGC序列也有一定的亲缘关系。因此,我们推测,该基因所编码的蛋白产物可能是一种环化核苷酸调节的离子通道,将该基因命名为GhCNGC2。3.跨膜结构和氨基酸序列的进一步分析表明,GhCNGC2的氨基端有6个保守的跨膜结构域（S1-S6）,在第5个和第6个跨膜结构域之间还有一个孔状结构域（Pore region）;在羧基端有一个保守的环化核苷酸结合域（CNBD）和一个钙调素结合域（CaMBD）,这些都是植物环化核苷酸调节的离子通道的典型序列特征。4. Northern blot表达分析表明,GhCNGC2在棉花叶片（子叶）中具有较高的表达水平,在茎中的表达水平较低,而在根中检测不到该基因的表达。GhCNGC2还受到多种胁迫的诱导,其中在NaCl处理的棉花幼苗中表达明显增加,而甘露醇和ABA处理也产生显著的诱导,低温、Cu2+和乙烯的诱导相对较弱。对不同萌发时期的棉花幼苗进行处理,发现该基因在不同的萌发时期表达水平基本不变。5.酵母互补试验证明,GhCNGC2作为一种离子通道,其K+的吸收能力在酵母突变体CY162中受到了内源钙调素的极大抑制,而表达GhCNGC2的缺失形式GhCNGC2ΔCaM和GhCNGC2ΔCNBD则可以使该突变体重新获得K+的吸收能力,从而互补该突变体,这表明CNBD和CaMBD作为羧基端调节区域的两个重要结构域,对GhCNGC2的功能起到了重要的调节作用。6.转基因植株内源离子含量测定的结果显示,超表达GhCNGC2及其缺失形式的拟南芥植株可以促进K+的吸收,抑制Na+的吸收,同时产生一个较高的K+/Na+比值,这表明该基因可能与胁迫条件下的种子萌发有密切关系。7.相比野生型拟南芥,超表达GhCNGC2基因及其缺失形式的转基因种子在高盐、盐碱、干旱、高温等各种胁迫条件下表现出较高的萌发率,说明GhCNGC2可能与种子萌发阶段的胁迫抗性紧密相关。另外,三种转基因种子所表现出来的萌发率高低关系可能是受到了环化核苷酸以及钙调素的双重调节。第二部分夏威夷海洋海绵的真菌多样性分析海洋真菌是海洋生态系统中一类重要的生物群落,由于其特殊的生存环境,以前对其研究较少。随着人们对海洋认识的深化,海洋生物的研究将成为二十一世纪生物研究的热点之一。海绵属于多孔动物门,在全球包括15000多种,分属于3个纲:钙质海绵纲（Calcarea）、六放海绵纲（Hexactinellida）和寻常海绵纲（Demopongiae）。作为滤食性动物,一千克的海绵组织一天可以过滤海水达24000升,海绵可以有效的从周围的海水环境中获取食物。各种浮游微生物都可以作为共附生微生物,生长在海绵的中质层中。共附生微生物的存在对寄主生物的健康和生活环境起到非常重要的作用。虽然在海洋海绵中共附生的原核生物已经被广泛的鉴定,但是人们还尚未使用过分子生物学的方法研究海绵中真菌群落的多样性。真菌是许多海洋和陆地生态系统重要的组成部分,它们也是海洋海绵中非常重要的一种生态群。本研究对现有的研究海绵中真菌群落的引物进行了可行性分析,选取了8对引物,分别构建rRNA或ITS克隆文库,都没有得到满意的结果;同时选取了11组DGGE引物,这些引物可以很好地扩增一些陆地环境样品中真菌的rRNA或ITS序列。结果发现,有3组能够成功地扩增海洋海绵中的真菌序列。DGGE结果显示,两种不同的夏威夷海洋海绵（Suberites zeteki和Mycale armata）中的真菌群落存在明显的差异,同时在海洋海绵和海水样品中的真菌群落也存在一定的差异。通过对所得DGGE条带的测序,在海绵S. zeteki中鉴定了23种真菌的存在;而在海绵M. armata中鉴定了21种真菌的存在。这些真菌属于11个不同的目,其中包括子囊菌门（Ascomycota）7个目,担子菌门（Basidiomycota）4个目,并且有5个目（Malasseziales, Corticiales, Polyporales, Agaricales和Dothideomycetes et Chaetothyriomcetes incertae sedis）是在海洋海绵中的首次鉴定。在S. zeteki和M. armata中,分别有7个和6个可能的真菌新种被鉴定出来,这些序列与它们在GenBank中的对应序列的序列相似性小于98%。系统进化分析发现,这些来自于海洋海绵的真菌序列与一些其他的来自于海洋生境的序列一起属于“海洋真菌”进化支。本研究是首次应用分子生物学的方法鉴定海洋海绵中的真菌群落,为以后进一步的研究海绵共附生微生物群落提供了新的思路和方法。

论文目录

• 第一部分
• 中文摘要
• 英文摘要
• 1. 前言
• 1.1 植物的抗逆性与抗逆机制
• 1.1.1 离子平衡和渗透调节
• 1.1.2 抗氧化防御系统
• 1.1.3 转录因子
• 1.1.4 胁迫相关蛋白
• 1.1.5 信号转导调节
• 1.2 棉花的抗逆研究
• 1.2.1 棉花的抗盐研究
• 1.2.2 棉花的抗干旱和抗低温研究
• 1.3 植物环化核苷酸调节的离子通道的研究进展
• 1.3.1 植物CNGC 的分子结构
• 1.3.2 植物 CNGC 家族的种类与分布
• 1.3.3 植物CNGC 可能的作用机制
• 1.3.4 植物CNGC 的主要功能
• 1.4 本研究的目的与意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 植物材料培养与处理
• 2.1.3 载体与菌株
• 2.1.4 其他材料
• 2.1.5 实验引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 RNA 的提取
• 2.2.1.1 利用RNeasy Plant Mini Kit 提取总RNA
• 2.2.1.2 利用TRIZOL 试剂盒提取RNA
• 2.2.1.3 CTAB 法提取植物总RNA
• 2.2.2 RNA 的纯化
• 2.2.3 cDNA 第一条链的合成
• 2.2.4 双链cDNA 的合成
• 2.2.5 DNA 片段与克隆载体的连接
• 2.2.6 大肠杆菌DH5α感受态的制备
• 2.2.7 大肠杆菌细胞的转化
• 2.2.8 质粒DNA 的提取
• 2.2.9 凝胶电泳中DNA 片段的回收
• 2.2.10 序列测定
• 2.2.11 GhCNGC2 cDNA 全长的获得
• 2.2.11.1 5’RACE PCR 获得 5’端序列
• 2.2.11.2 3’RACE PCR 获得 3’端序列
• 2.2.11.3 GhCNGC2 cDNA 全长的获得
• 2.2.12 Northern 杂交
• 2.2.12.1 RNA 提取及电泳
• 2.2.12.2 转膜与烘膜
• 2.2.12.3 探针合成
• 2.2.12.4 预杂交及杂交
• 2.2.13 酵母表达载体的构建与酵母转化
• 2.2.13.1 试剂配制
• 2.2.13.2 酵母表达载体的构建
• 2.2.13.3 酵母感受态细胞的制备和乙酸锂转化
• 2.2.13.4 酵母互补实验
• 2.2.14 植物表达载体的构建与拟南芥转化
• 2.2.14.1 植物正义表达载体的构建
• 2.2.14.2 农杆菌感受态细胞制备及转化
• 2.2.14.3 农杆菌的培养
• 2.2.14.4 农杆菌介导的拟南芥转化
• 2.2.14.5 转基因拟南芥的鉴定
• 2.2.15 离子含量测定
• 2.2.16 拟南芥种子萌发实验
• 3. 结果与分析
• 3.1 棉花环化核苷酸调节的离子通道基因GhCNGC2的获得与序列分析
• 3.1.1 GhCNGC2 中间片段的获得
• 3.1.2 GhCNGC2 5’端片段的分离
• 3.1.3 GhCNGC2 3’端片段的分离
• 3.1.4 GhCNGC2 全长的分离
• 3.1.5 GhCNGC2 的序列分析
• 3.2 棉花GhCNGC2 的功能鉴定
• 3.2.1 棉花GhCNGC2 的表达分析
• 3.2.2 棉花GhCNGC2 基因在酵母突变体中的表达
• 3.2.3 GhCNGC2 基因在拟南芥中的超表达及转基因拟南芥离子含量的测定
• 3.2.4 超表达GhCNGC2 及其缺失片段对转基因拟南芥在萌发阶段胁迫抗性的影响
• 4. 讨论
• 4.1 GhCNGC2 编码一种环化核苷酸调节的离子通道
• 4.2 全长GhCNGC2 在酵母与拟南芥中的功能差异
• 4.3 转基因拟南芥提高胁迫抗性可能的机制
• 4.4 CNGC 家族的应用前景及展望
• 5. 结论
• 6. 参考文献
• 第二部分
• 中文摘要
• 英文摘要
• 1. 前言
• 1.1 真菌
• 1.1.1 真菌研究方法概述
• 1.1.2 海洋真菌
• 1.1.2.1 海洋真菌的定义
• 1.1.2.2 海洋真菌的分布、分类及多样性
• 1.1.2.3 海洋真菌的附着基质
• 1.1.2.4 海洋真菌的研究意义
• 1.2 海洋海绵与共附生微生物
• 1.2.1 海洋海绵
• 1.2.2 海洋海绵的共附生微生物及其多样性
• 1.2.3 共附生微生物对海洋海绵的生物学意义
• 1.3 海洋海绵共附生微生物的研究方法
• 1.3.1 构建克隆文库法
• 1.3.2 变性梯度凝胶电泳（DGGE）法
• 1.4 入侵型海绵在夏威夷瓦胡岛 Kaneohe 海湾的生长及危害
• 1.4.1 入侵型海绵在夏威夷瓦胡岛Kaneohe 海湾的生长
• 1.4.2 入侵型海绵对夏威夷瓦胡岛Kaneohe 海湾造成的生态危害
• 1.5 本研究的目的与意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株及质粒
• 2.1.2 酶与各种生化试剂
• 2.1.3 实验引物
• 2.1.4 样品的采集与预处理
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 海绵样品的处理
• 2.2.2 海水样品的处理
• 2.2.3 海绵组织和海水滤膜总 DNA 的提取
• 2.2.4 本研究所用的PCR 反应体系及程序
• 2.2.5 凝胶中DNA 片段的回收
• 2.2.6 PCR 产物的纯化
• 2.2.7 DNA 片段与克隆载体的连接
• 2.2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.9 大肠杆菌的转化
• 2.2.10 大肠杆菌质粒DNA 的提取
• 2.2.11 真菌rRNA 或ITS 克隆文库的构建与筛选
• 2.2.12 变性凝胶梯度电泳分析
• 2.2.13 测序及系统进化分析
• 3. 结果与分析
• 3.1 鉴定海洋海绵中真菌群落通用引物的可行性分析
• 3.2 DGGE 分析海洋海绵中的真菌群落
• 3.3 海洋海绵中真菌群落的序列分析
• 3.4 海洋海绵中不可培养型真菌的系统进化分析
• 3.4.1 担子菌门
• 3.4.2 子囊菌门
• 4. 讨论
• 4.1 鉴定真菌群落的引物的选择
• 4.2 传统的真菌鉴定方法与分子生物学方法的比较
• 4.3 海洋真菌与海绵真菌
• 5. 结论
• 6. 参考文献
• 附录
• 致谢