猪Suv39h2、G9α和LSD1基因的分离、表达及功能研究

论文摘要

表观遗传学是研究表观遗传变异的遗传学分支学科,它是指在不改变DNA序列的情况下,在碱基序列外的各种修饰和与之相关的各种蛋白质或RNA的协同作用下,调控基因的表达,以完成生命周期或适应环境变化,而且这套系统还能在世代之间传递。表观遗传学主要包括组蛋白密码、DNA甲基化、RNA干涉、基因组印记等多个方面。作为组蛋白密码之一的组蛋白甲基化,在基因表达调控、X染色体失活、基因组印迹、DNA修补中具有重要作用。目前关于猪表观遗传学的研究鲜有报道。本论文选择组蛋白甲基转移酶基因Suv39h2、G9a,以及组蛋白去甲基化酶基因LSD1进行研究,通过对其分离、克隆、表达谱分析、原核表达、多态性位点检测及其与性状的关联分析,为进一步研究3个基因与猪生产发育、性状形成或调控之间的关系打下基础。主要研究结果如下:1.依据人Suv39h2、G9a和LSD1基因的mRNA序列,通过NCBI网站上Blast分析找出与人Suv39h2、G9a和LSD1基因同源的猪EST序列,构建猪EST重叠群并设计猪的特异引物克隆得到猪Suv39h2、G9a和LSD1（两个转录本）基因含编码区全长的cDNA序列,提交GenBank,登录号分别为EU219913、EU219914、EU219915（转录本1）和EU219916（转录本2）;采用生物信息学分析软件对基因的功能或性质进行了预测。2.以梅山猪的心、肝、脾、肺、肾、子宫、卵巢、肌肉、脂肪、胃、小肠等组织为材料,利用半定量RT-PCR检测了猪Suv39h2、G9a和LSD1基因的组织表达谱,结果发现3个基因在上述11种组织中几乎都表达,其中Suv39h2基因在肌肉、卵巢和脾脏中相对高表达;LSD1基因的两种转录本同时表达,且在卵巢、肾脏和脾脏中相对高表达。3.以出生后3d、35d、60d、120d和180d梅山猪肌肉组织为材料,利用半定量RT-PCR检测了猪Suv39h2、G9a和LSD1基因在不同发育时期肌肉组织中的表达谱,结果发现3个基因的表达趋势是大致相同的,即均在生长早期高表达,其中G9a基因在35d时表达量是最高的,但Suv39h2和LSD1基因在3d时表达量是最高的,且LSD1基因的两个转录本均同时表达。4.构建了猪Suv39h2、G9a基因重组原核表达载体pGEX-KG,利用SDS-PAGE及Western blotting检测出两个重组原核表达载体均成功表达出了目的蛋白。5.依据人G9a基因的cDNA和DNA信息,通过生物信息学及比较基因组学的策略,分离、克隆出猪G9aDNA序列,提交GenBank（登录号:EU709015）。在在大白猪和梅山猪中得到G9a基因的部分DNA序列,比对后发现了41个SNP,其中有32个为转换（其中有18个C/T转换）,7个为颠换,2个为插入/缺失突变。6.应用PCR-RFLP和PCR-PAGE分析技术,在分离的猪G9a基因第23、25内含子以及3′UTR区各发现了一个碱基突变多态性位点。分析了三个位点在不同群体中的多态性,计算了三个位点的基因型和基因频率,比较了各基因型在不同猪群的分布差异。7.以华中农业大学试验猪场2003、2004年屠宰的大白猪×梅山猪杂种猪F2代群体为试验猪群,对G9a基因中存在的SNP进行了性状关联分析。初步分析该基因第23内含子的碱基突变多态性位点与屠宰率存在显著相关（p＜0.05）,与皮率、骨率、肥肉率、瘦肥肉比率、至第一颈椎胴体长、至第一肋胸胴体长、肩部最厚处背膘厚、6-7肋骨处背膘厚、胸腰椎间背膘厚、臀部背膘厚、平均背膘厚存在极显著相关（p＜0.01）;初步分析该基因第25内含子的碱基突变多态性位点与皮率、屠宰率、内脂率、股二头肌pH值和头半棘肌pH值存在显著相关（p＜0.05）;初步分析该基因3’非编码区的碱基突变多态性位点与肩部最厚处背膘厚、胸腰椎间背膘厚、平均背膘厚、股二头肌pH值和肌内脂肪含量存在显著相关（p＜0.05）,与皮率、6-7肋骨处背膘厚存在极显著相关（p＜0.01）。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 引言
• 2 组蛋白密码假说
• 3 组蛋白甲基转移酶和组蛋白去甲基化酶
• 3.1 组蛋白甲基转移酶
• 3.2 组蛋白去甲基化酶
• 4 组蛋白甲基化的生物学功能
• 4.1 组蛋白甲基化与组成型异染色质的形成
• 4.2 组蛋白甲基化与X染色体失活
• 4.3 组蛋白甲基化与基因印记
• 4.4 组蛋白甲基化与基因的转录调控
• 5 组蛋白去甲基化与基因调控
• 6 组蛋白修饰与肌肉形成
• 7 Suv39h2、G9a和LSD1基因研究进展
• 7.1 Suv39h2
• 7.2 G9a
• 7.3 LSD1
• 8 研究的目的和意义
• 第二章 材料和方法
• 1 试验材料
• 1.1 试验样品
• 1.1.1 猪组织样品
• 1.1.2 试验猪群体和性状测定
• 1.2 主要仪器和设备
• 1.3 主要药品及试剂
• 1.4 载体和菌株
• 1.5 缓冲液及常用试剂的配制
• 2 试验方法
• 2.1 猪Suv39h2、G9a和LSD1基因cDNA的分离
• 2.1.1 猪组织总RNA的提取及cDNA第一链的合成
• 2.1.1.1 猪组织总RNA的提取
• 2.1.1.2 RNA完整性的检测
• 2.1.1.3 猪组织总RNA的RNase-free DNase Ⅰ处理及纯化
• 2.1.1.4 cDNA第一链的合成
• 2.1.2 依据"电子克隆"策略设计引物
• 2.1.3 RT-PCR方法扩增cDNA
• 2.1.3.1 RT-PCR反应
• 2.1.3.2 RT-PCR反应产物的检测
• 2.1.4 cDNA产物的回收与纯化
• 2.1.5 克隆与测序
• 2.1.5.1 载体连接
• 2法）'>2.1.5.2 感受态细胞制备（CaCl₂法）
• 2.1.5.3 连接产物的转化
• 2.1.5.4 阳性克隆的PCR鉴定和测序
• 2.1.6 cDNA序列的生物信息学分析
• 2.2 猪Suv39h2、G9a和LSD1基因的时空表达谱分析
• 2.2.1 引物的设计
• 2.2.2 RT-PCR反应
• 2.2.3 RT-PCR反应产物的检测
• 2.3 原核表达载体的构建及Western Blotting鉴定
• 2.3.1 引物
• 2.3.2 质粒的提取及酶切鉴定
• 2.3.3 重组蛋白的诱导表达及SDS-PAGE检测
• 2.3.3.1 重组蛋白表达条件的优化
• 2.3.3.2 重组蛋白的SDS-PAGE检测
• 2.3.4 重组蛋白的Western Blotting鉴定
• 2.4 猪G9a基因DNA的分离
• 2.4.1 猪血液基因组DNA的提取、浓度测定及质量检测
• 2.4.1.1 猪基因组DNA的提取
• 2.4.1.2 猪基因组DNA的浓度测定和质量检测
• 2.4.2 引物设计
• 2.4.3 猪G9a基因PCR扩增和序列分析
• 2.4.3.1 PCR扩增
• 2.4.3.2 PCR产物电泳检测
• 2.4.3.3 PCR产物回收与纯化、克隆、测序
• 2.3.3.4 猪G9a基因序列分析
• 2.5 猪G9a基因PCR-RFLP分析
• 2.6 统计分析
• 第三章 结果与分析
• 1 猪Suv39h2、G9a和LSD1基因cDNA分离
• 1.1 猪组织总RNA的提取
• 1.2 猪Suv39h2基因cDNA全序列的克隆及序列分析
• 1.2.1 猪Suv39h2基因RT-PCR扩增及测序
• 1.2.2 猪Suv39h2基因cDNA序列及推导的氨基酸序列
• 1.2.3 推导的猪Suv39h2基因蛋白质的基本特征分析
• 1.3 猪G9a基因cDNA全序列的克隆及序列分析
• 1.3.1 猪G9a基因RT-PCR扩增及测序
• 1.3.2 猪G9a基因cDNA序列及推导的氨基酸序列
• 1.3.3 推导的猪G9a基因蛋白质的基本特征分析
• 1.4 猪LSD1基因cDNA全序列的克隆及序列分析
• 1.4.1 猪LSD1基因RT-PCR扩增及测序
• 1.4.2 猪LSD1基因cDNA序列及推导的氨基酸序列
• 1.4.3 推导的猪LSD1基因蛋白质的基本特征分析
• 2 猪Suv39h2、G9a和LSD1基因的时空表达谱
• 2.1 猪Suv39h2、G9a和LSD1基因的组织表达谱
• 2.2 猪Suv39h2、G9a和LSD1基因在不同发育时期肌肉组织中的表达谱
• 3 Suv39h2和G9a基因的原核表达
• 3.1 原核表达载体的构建
• 3.1.1 融合蛋白Suv39h2原核表达载体的构建
• 3.1.2 融合蛋白G9a原核表达载体的构建
• 3.2 表达产物的SDS-PAGE分析
• 3.2.1 融合蛋白Suv39h2表达产物的SDS-PAGE分析
• 3.2.1.1 最佳诱导时间的确定
• 3.2.1.2 IPTG最佳诱导浓度的确定
• 3.2.1.3 融合表达产物的可溶性分析
• 3.2.2 融合蛋白G9a表达产物的SDS-PAGE分析
• 3.2.2.1 最佳诱导时间的确定
• 3.2.2.2 IPTG最佳诱导浓度的确定
• 3.2.2.3 融合表达产物的可溶性分析
• 3.3 表达产物的Western blotting分析
• 3.3.1 融合蛋白Suv39h2表达产物的Western blotting分析
• 3.3.2 融合蛋白G9a表达产物的Western blotting分析
• 4 猪G9a基因的基因组序列及结构分析
• 4.1 猪G9a基因DNA序列扩增结果
• 4.2 猪G9a基因DNA序列生物信息学分析
• 5 猪G9a基因的基因型分型与遗传效应分析
• 5.1 PCR-Bsh1236I-RFLP
• 5.2 PCR-9bp插入/缺失变异-PAGE
• 5.3 PCR-MboI-RFLP
• 第四章 讨论
• 1 "电子克隆"分离新基因
• 2 基因的选择性
• 3 G9a、Suv39h2和LSD1基因的时空表达谱
• 4 基因的原核表达
• 5 中外不同猪种间基因序列的多态性
• 6 遗传效应分析
• 6.1 G9a基因第23内含子的多态性
• 6.2 G9a基因第25内含子的多态性
• 6.3 G9a基因3′UTR的多态性
• 第五章 小结
• 1 本研究获得的结果
• 2 本研究的创新点
• 3 本研究的不足之处
• 4 下一步值得研究的工作
• 参考文献
• 致谢