论文摘要
老鹤草为我国传统中药,2005版中国药典收载的老鹤草为栊牛儿苗（Erodiumstephanianum Wild.）、老鹤草（Geranium wilfordii Maxim.）、野老鹤草（Geraniumcarolinianum L.）的干燥地上部分。具有祛风湿、通经络、止泻痢的功能。在我国老鹤草品种较多,分布较广,资源丰富。野老鹤草（Geranium carolinianum L.）在民间作为习用药材应用较多,也有其水煎剂初步临床治疗乙肝病例的报导,但其作用的物质基础及化学成分迄今末见详细报道,在抗乙肝病毒（HBV）方面更没有系统研究。为研究野老鹳草在抗HBV方面的作用,本文采用天然药物化学、药理学、分析化学、分子生物学等手段,对野老鹳草进行了抗乙肝病毒有效部位的系统研究。在生物活性指导下分离提取了总黄酮提取物,并首次发现该总黄酮提取物具有良好的、独特的体内外抑制乙肝病毒的效果。从抗病毒有效部位中分离得到15个化合物,除金丝桃苷外,其它化合物均为首次从野老鹳草中分离得到,其中槲皮素—3—O—β—D—（6″—没食子酰基）半乳糖苷、牡荆苷为首次从老鹳草属植物中分离得到。本文还探讨了黄酮类化合物抗HBV的构效关系,并首次报道了老鹳草素和金丝桃苷体外对HBsAg和HBeAg较强的抑制作用。一、野老鹳草抗乙肝病毒有效部位的分离与确定1、对野老鹳草及其抗乙肝病毒有效部位的确认从大量中草药的水煎剂中,通过体外试验发现野老鹳草具有较强的抑制HBsAg和HBeAg的作用。采用有机溶媒提取分离,发现野老鹳草乙酸乙酯提取物具有较强的抑制乙肝病毒HBsAg和HBeAg分泌的能力,进一步明确乙酸乙酯提取物的主要成分以黄酮为主。2、对野老鹳草分离纯化黄酮的工艺进行确认正交实验结果的直观分析和方差分析,显示酒精提取时最佳提取野老鹳草黄酮工艺条件为回流时间1 h,提取次数3次,药材与溶剂比1:8,乙醇浓度为50%。又通过对影响大孔树脂吸附及解吸的各种因素进行研究,发现D—101大孔吸附树脂较适合分离纯化野老鹳草总黄酮,其分离纯化总黄酮的工艺为:药液浓度以生药计1.0 g/ml,吸附速度为1.0 ml/min,洗脱速度为1 ml/min,洗脱溶剂为70%乙醇,5倍柱床体积的70%乙醇可将总黄酮基本洗脱完全。该工艺总黄酮收率高,成本低,操作简便,避免使用有机溶剂,安全,适宜大规模生产使用。通过比较野老鹳草乙酸乙酯提取物和大孔树脂D—101分离提取物的抗乙肝病毒活性和细胞毒性,发现乙酸乙酯提取物细胞毒性较强,而大孔树脂D—101的提取物细胞毒性相对较弱,抑制乙肝病毒HBsAg和HBeAg分泌的能力较强,有希望开发成抗乙肝病毒新药。二、野老鹳草总黄酮提取物抗乙肝病毒药效学试验1、野老鹳草总黄酮提取物对HBV整合的肝癌细胞HepG22.215细胞半数毒性浓度TC50为152.13μg/ml（10 d）。2、HepG22.2.15细胞模型试验显示,当细胞培养液中野老鹳草总黄酮提取物浓度为1 00μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml和6.25μg/ml时,药物作用10天对HBsAg抑制率分别达到了69.90%、30.54%、12.02%、8.92%和3.40%,IC50为68.39μg/ml,治疗指数（TI）为2.22;对HBeAg抑制率分别达到了59.01%、39.43%、23.93%、16.95%和12.39%,IC50为72.06μg/ml,治疗指数（TI）为2.11。在100μg/ml浓度下,药物作用10天,经Southern Blot检测野老鹳草总黄酮提取物对细胞HBV-DNA的抑制率达到了38.56%。同样条件下荧光定量实时-PCR（FQ-PCR）显示对HBV DNA拷贝数的抑制为35.9%。以上表明野老鹳草总黄酮体外能抑制乙肝病毒,并显示量效关系。3、体内试验:野老鹳草总黄酮提取物经鸭乙型病毒性肝炎模型试验,结果显示对血清病毒DNA有明显的抑制。口服给药10天,三个不同的给药剂量112 mg/kg、56 mg/kg、28 mg/kg对血清病毒DNA和肝脏病毒的抑制有剂量依赖关系。经dotblot检测,112 mg/kg、56 mg/kg、28 mg/kg的剂量给药10天,对血清病毒DNA的抑制分别为69.00%、50.57%、和41.30%,ED50为47.54 mg/kg;停药3天后,抑制率分别维持在57.84%、32.63%、和21.24%,ED50为91.69 mg/kg。相比对照药物拉米夫定,停药后的反跳不明显。野老鹳草总黄酮提取物对肝脏病毒DNA也有较好抑制,经Southern Blot检测,112 mg/kg的剂量用药10天对肝脏病毒DNA的抑制率为45.37%。经病理切片观察,野老鹳草总黄酮对鸭乙肝病毒引起的肝脏水样变性有明显的减轻效果,经口服给药112 mg/kg和56mg/kg 5天就可以看到血窦,在停药3天后,仍可见到血窦,未见脂肪肝病变。三、活性部位化学组分的分离、分析及抗病毒活性研究从野老鹳草总黄酮提取物中分离得到金丝桃苷（hyperoside）、陆地棉苷（hirsutrin）、槲皮素（quercetin）、槲皮素—3—O—β—D—（6″—没食子酰基）半乳糖苷[quercetin-3-O-β—D—（6″—galloyl）galactoside]、鞣花酸（ellagic acid）、没食子酸（gallic acid）、山奈酚（kaempferol）、杨梅素（myricetin）、原儿茶酸（protocatechuic acid）、柯里拉京（corilagin）、老鹳草素（geraniin）、山奈酚—7—O—鼠李糖苷（kaempferol-7-O-rhamnoside）、槲皮甙（quercitrin）、山奈酚-7—O—α—L—呋喃阿拉伯糖苷（kaempferol-7-O-α—L—arabinofuranoside）、牡荆苷（Vitexin）等15个化合物。其中除金丝桃甙外,其它化合物为首次从野老鹳草中分离得到,且槲皮素—3—O—β—D—（6″—没食子酰基）半乳糖苷、牡荆苷为首次从老鹳草属植物中分离得到。通过比较所分离化合物体外抗乙肝病毒的效果,首次发现老鹳草素、金丝桃甙体外有较强的抑制乙肝病毒的作用,鞣花酸也具有较强的体外抑制乙肝病毒HBsAg和HBeAg分泌的效果,以上三个化合物的活性可用于解释野老鹳草总黄酮抗乙肝病毒的效果。并且第一个发现黄酮甙元B环上羟基的位置和数目影响其抗乙肝病毒的活性,活性大小依次为杨梅素＞槲皮素＞山奈酚。黄酮母核3位羟基上糖取代基的不同显著影响抗乙肝病毒的活性,其中3位上含有半乳糖的黄酮苷具有较强的抑制乙肝病毒活性的效果。生物活性研究发现酚羟基的数目影响抗乙肝病毒的效果,如老鹳草素和柯里拉京具有非常强的体外抗乙肝病毒的效果。建立了高效液相色谱法（HPLC）测定野老鹳草总黄酮中金丝桃甙含量的方法,为进一步质量标准的研究奠定了基础。