首页> 正文

EGS抑制HCMV UL49基因表达及病毒复制的研究

2020-11-23阅读(180)

EGS抑制HCMV UL49基因表达及病毒复制的研究

论文摘要

采用RT-PCR技术，在HCMV（AD169）感染的人胚肺成纤维细胞中检测到了HCMVUL49mRNA，因而首次在RNA水平证实HCMV UL49基因的表达。此外，进一步检测不同感染时间（1h、5h、9h、12h、24h、48h和72h）受染细胞中UL49mRNA的表达情况，初步判断UL49并非即刻早期表达基因（IE），而可能是一个早期（β2）表达基因。 根据HCMV UL49mRNA的序列，借助计算机软件模拟，设计了一组针对HCMV UL49mRNA不同靶位的EGS（共8个，分别命名为EGS1～EGS8），以此作为筛选库。通过胞外初筛、胞内复筛和胞内抗病毒活性的检测，拟从中筛选出具有抗病毒活性的EGS。1)胞外初筛：首先从HeLa细胞中提取具体外切割活性的RNase P，并以此建立了一种EGS胞外筛选系统。通过该系统证实，所设计的八个EGS中，有六个EGS具有靶向引导切割活性，它们分别是EGS1、EGS3、EGS4、EGS5、EGS6和EGS7，其余的EGS2和EGS8则无明显活性。在具活性的六个EGS中，各EGS的靶向引导切割效率有所不同。其中EGS1、EGS3、EG6和EGS7四个EGS的活性较强，靶向引导切割的效率均超过50％；而EGS4和EGS5的靶向引导切割效率则均低于50％。2)胞内复筛中：首先将UL49基因克隆至pGEFP-N1质粒绿色荧光蛋白基因的上游，以构建UL49-绿色荧光蛋白融合表达载体（pUL49／EGFP-N1）。将EGS与该融合蛋白表达载体以脂质体共转染HeLa细胞（同时以红色荧光质粒pDsRed2-C1，作为转染的内对照），建立了一种有效的EGS胞内复筛系统。通过荧光显微观察、Typhoon扫描及流式细胞仪检测，证实胞外初筛中活性较强的四个EGS中，只有EGS1、EGS3和EGS6具有明显的胞内靶向抑制活性，而EGS7的活性则较弱。3)胞内抗病毒活性的检测：将初筛及复筛证实有效的EGS分别以脂质体转染HELF细胞，然后再以AD169病毒株感染。在感染24h、48h和72h后，抽提感染细胞的总RNA，以相对荧光定量PCR（β-actin作内参）检测其中HCMVUL49mRNA的含量。结果表明：EGS1、EGS3、EGS6和EGS7对HCMV UL49mRNA表达的抑制率分别为74.87±2.85％、17.85±4.16％、89.77±0.91％和35.40±1.92％。其中，EGS1和EGS6的靶向抑制活性明显高于其余两个EGS（P＜0.01）。进一步以EGS1和EGS6作为研究对象，通过绝对荧光定量PCR的方法检测EGS转染后病毒培养液中HCMV基因组DNA的变化，以此评价EGS1及EGS6对胞内HCMV复制的抑制活性。结果显示，E6S1和EGS6转染后，病毒的增殖曲线均明显低于未转染EGS的对照组。从而证实了EGS1和EGS6在胞内的抗病毒效应。其中，EGS6的抑制作用较强（抑制率为89.62±2.55％～95.9±1.98％），EGS1的抑制作用则相对较弱（抑制率为40.25±1.05％～70.85±2.03％）。 总之，通过本研究一系列的筛选步骤，获得两种具有胞内抗HCMV活性的EGS序列（EGS1和EGS6），从而为新型抗HCMV反义药物的进一步研究与开发奠定了基础。

论文目录

  • 第一部分 中文摘要
  • 第二部分 英文摘要
  • 第三部分 前言
  • 第四部分 研究报告
  • 实验一:HCMV UL49基因表达的初步鉴定
  • 一、前言
  • 二、技术路线
  • 三、材料与方法
  • 1.主要仪器
  • 2.材料及试剂
  • 3.实验内容与方法
  • 3.1 人胚肺成纤维细胞的培养
  • 3.2 病毒的感染及培养
  • 3.3 病毒的感染的鉴定
  • 3.4 HCMV UL49mRNA的检测
  • 四、结果与分析
  • 1.病毒的培养及鉴定
  • 1.1 HELF的培养
  • 1.2 病毒感染HELF后的CPE
  • 1.3 病毒感染的PCR鉴定
  • 2.HCMV UL49mRNA的鉴定
  • 2.1 RNA的抽提与纯化
  • 2.2 纯化RNA的鉴定
  • 2.3 HCMV UL49mRNA的检测
  • 2.4 不同感染时间UL49mRNA的检测
  • 五、讨论
  • 1.关于病毒的培养与鉴定
  • 2.HCMV UL49mRNA的检测
  • 3.HCMV UL49基因表达时相的初步鉴定
  • 4.HCMV UL49基因编码蛋白的功能预测
  • 实验二:EGS的设计及胞外初筛
  • 一、前言
  • 二、技术路线
  • 三、材料与方法
  • 1.实验涉及的主要仪器
  • 2.实验材料及试剂
  • 3.实验内容与方法
  • 3.1 EGS的设计合成
  • 3.2 HCMV UL49基因的克隆及体外转录
  • 3.3 RNA marker的制备
  • 3.4 RNase P的提取及活性鉴定
  • 3.5 胞外切割实验
  • 四、结果与分析
  • 1.EGS的设计合成
  • 2.HCMV UL49基因的克隆
  • 2.1 UL49基因的PCR扩增
  • 2.2 UL49基因克隆质粒（PU49）的鉴定
  • 2.3 UL49基因的体外转录
  • 3.人类RNase P的提取及活性鉴定
  • 3.1 RNase P的提取
  • 3.2 RNase P底物的制备
  • 3.3 最佳切割时间的确定
  • 3.4 梯度洗脱过程中RNase P活性的检测
  • 4.EGS胞外引导活性的检测
  • 五、讨论
  • 1.关于EGS的设计
  • 2.胞外切割系统的建立
  • 2.1 RNase P的粗纯化
  • 2.2 RNase P的活性鉴定
  • 2.3 RNase P最佳反应条件的摸索
  • 3.EGS的胞外筛选
  • 3.1 筛选库中各EGS引导切割活性的比较
  • 3.2 EGS引导切割的靶向性分析
  • 3.3 关于对照EGS（C-EGS）
  • 实验三:EGS的胞内复筛
  • 前言
  • 一、技术路线
  • 二、材料与方法
  • 1.实验涉及的主要仪器
  • 2.实验材料及试剂
  • 3.实验内容与方法
  • 3.1 pUL49/EGFP-N1融合蛋白表达载体的构建
  • 3.2 EGS的制备
  • 3.3 红色荧光表达载体（pDsRed2-Cl）的制备
  • 3.4 共转染
  • 3.5 荧光观察与检测
  • 三、结果与分析
  • 1.UL49基因PCR扩增产物的电泳鉴定
  • 2.pUL49/EGFP-N1重组质粒的鉴定
  • 3.EGS抑制UL49基因表达活性的检测
  • 3.1 荧光显微镜观察
  • 3.2 Typhoon9200荧光扫描
  • 3.3 流式细胞检测
  • 4.EGS抑制UL49基因表达的浓度因素
  • 四、讨论
  • 实验四:EGS胞内抗病毒活性的鉴定
  • 一、技术路线
  • 二、材料与方法
  • 1.主要仪器
  • 2.材料及试剂
  • 3.实验内容与方法
  • 3.1 人胚肺成纤维细胞（HELF）的培养
  • 3.2 EGS的脂质体转染
  • 3.3 EGS对HCMV基因表达的抑制作用
  • 3.4 EGS对病毒增殖曲线的影响
  • 三、结果与分析
  • 1.逆转录产物的鉴定
  • 2.病毒DNA的鉴定
  • 3.HCMV感染细胞内UL49mRNA的定量检测
  • 4.HCMV增殖曲线的测定
  • 4.1 标准曲线的制备
  • 4.2 熔解曲线的测定
  • 4.3 病毒增殖曲线的测定
  • 5.UL49 mRNA水平的下调对HCMV其他基因表达的影响
  • 四、讨论
  • 第五部分 小结
  • 第六部分 参考文献
  • 第七部分 文献综述
  • 综述一:HCMV的病原生物学
  • 一、病毒学特征
  • 二、流行病学特点
  • 三、致病性
  • 四、免疫性
  • 五、HCMV感染的诊断
  • 六、HCMV感染的治疗
  • 七、HCMV感染的预防
  • 综述二:反义技术及其在抗病毒研究领域的应用
  • 一、反义技术的创建及其策略
  • 二、反义技术的类型
  • 三、反义技术中的关键问题
  • 四、反义技术在抗病毒研究中的应用
  • 五、结束语
  • 综述三:核酶作用机制的研究进展
  • 一、大分子核酶
  • 二、小分子核酶
  • 三、其他核酶
  • 第八部分 附录
  • 附录一 缩略词中英文对照
  • 附录二 基因序列
  • 1.PU49质粒的测序结果
  • ser克隆质粒的测序结果'>2.ptRNAser克隆质粒的测序结果
  • 3.pUL49/EGFP-N1质粒的测序结果
  • 4.HCMV（AD169）UL49在genebank登录的序列
  • 附录三 溶液配方
  • 附录四 其他
  • 第九部分 致谢

    • 相关论文文献

    • [1].换热单元体展布特征对水平井多级压裂的EGS采热的影响[J]. 太阳能学报 2020(07)
    • [2].水流损失和热补偿共同作用对增强型地热系统(EGS)产能影响的研究[J]. 应用力学学报 2020(01)
    • [3].EGS程序电子输运模型研究进展[J]. 核电子学与探测技术 2009(01)
    • [4].EGS通信网络可靠性分析研究[J]. 电子设计工程 2015(15)
    • [5].EGS水岩作用对地热储层孔渗特征影响的模拟研究[J]. 重庆交通大学学报(自然科学版) 2017(10)
    • [6].增强型地热系统(EGS)土酸化学刺激剂对热储层的改造[J]. 中南大学学报(自然科学版) 2017(01)
    • [7].基于平行多裂隙模型美国沙漠峰地热田EGS开发数值模拟研究[J]. 地球物理学进展 2017(02)
    • [8].基于平行多裂隙模型的美国沙漠峰地热田EGS热恢复研究[J]. 工程热物理学报 2017(01)
    • [9].EGS热储基于微震数据反演模化及其采热性能分析[J]. 化工学报 2018(12)
    • [10].平行多裂隙模型中换热单元体对EGS釆热的影响[J]. 地球物理学进展 2016(03)
    • [11].热储分层影响EGS采热的数值模拟研究[J]. 新能源进展 2014(04)
    • [12].裂隙展布特征对EGS采热影响的理论数值模拟研究[J]. 地球物理学进展 2020(02)
    • [13].渤海湾盆地应用增强型地热系统(EGS)的地质分析[J]. 地质与勘探 2013(01)
    • [14].美国干热岩“地热能前沿瞭望台研究计划”与中美典型EGS场地勘查现状对比[J]. 地学前缘 2019(02)
    • [15].应用于EGS的两级闪蒸-Kalina循环联合发电系统热力性能研究[J]. 应用科技 2019(06)
    • [16].EGS场中高红移极亮红外星系的形态与结构[J]. 天文学报 2014(06)
    • [17].EGS载热流体水岩作用对人工地热储层裂隙物性特征的影响[J]. 科技导报 2014(14)
    • [18].土壤中光子致地表光子辐射剂量率转换系数的EGS模拟[J]. 辐射防护通讯 2014(03)
    • [19].增强型地热系统(EGS)的裂隙模拟方法[J]. 上海国土资源 2011(03)
    • [20].松辽盆地增强型地热系统(EGS)地热能开发热-水动力耦合过程[J]. 吉林大学学报(地球科学版) 2014(05)
    • [21].中国EGS示范工程靶区选址与指标矩阵评价[J]. 科技导报 2015(08)
    • [22].EGS地热能开发过程中水岩作用对热储层特征的影响[J]. 可再生能源 2014(07)
    • [23].增强地热系统EGS的人工热储技术[J]. 机械设计与制造 2008(09)
    • [24].工质变物性对EGS热开采过程影响的数值模拟[J]. 吉林大学学报(地球科学版) 2015(04)
    • [25].土酸注入速率对EGS热储层改造效果影响的实验研究[J]. 可再生能源 2015(11)
    • [26].FixAl及同位素方法在EGS返排液研究中的应用[J]. 地学前缘 2020(01)
    • [27].CRH2C型动车组EGS自动闭合故障分析及处理[J]. 机车电传动 2014(02)
    • [28].CRH2型动车组保护接地开关EGS误操作故障分析及改进措施[J]. 机车电传动 2009(04)
    • [29].增强型地热系统(EGS)资源开发利用研究[J]. 中国能源 2011(01)
    • [30].试论我国干热岩地热资源开发战略[J]. 水文地质工程地质 2015(03)

    标签：;  ;  ;  

    EGS抑制HCMV UL49基因表达及病毒复制的研究
    下载Doc文档

    猜你喜欢

    © 2025 毕速过 版权所有 鄂ICP备12018319号-5