芍药苷的单克隆抗体制备及其中药材的免疫法测定

论文摘要

分子生物学等生物技术的快速发展,为中药的研究开辟了许多新的途径。其中,应用小分子量中药活性成分的单克隆抗体（monoclonal antibodies,MAbs）建立的免疫测定系统已成为受体结合分析、酶测定等研究的一个重要工具,也是药用植物的一种定性定量分析技术,这些都与MAbs的特异亲和力、可大量生产等相关。但是,单克隆抗体用于现代中医药的研发方面的文献至今尚所见不多,因此,亟需探索有关单抗技术在中医药研究中的技术基础及其应用。本研究的目的就是通过制备芍药的主要活性成分一芍药苷（paeoniflorin,PF）的单克隆抗体,从而建立以此为基础的酶联免疫测定（enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA）方法,对尘药和方剂中的芍药苷进行定量分析。内容主要包括人工抗原的合成与鉴定、动物免疫及细胞融合、抗体筛选与纯化、MAbs性质测定、利用制成的单抗建立ELISA方法及其验证等。首先采用高碘酸钠法将PF分别与人血清白蛋白（albumin human serum,HSA）或鸡卵清白蛋白（ovalbumin,OVA）结合形成偶联物PF-HSA、PF-OVA。通过MAIDI-TOF MS和紫外光谱对偶联物进行鉴定,PF-HSA半抗原数＞9,人工抗原合成成功。再用聚乙二醇法（PEG 1450）将PF-HSA免疫的Balb/c小鼠脾细胞与对次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷（HAT）敏感的小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合形成杂交瘤细胞,细胞的融合得率较高,可达87.19%。通过HAT培养基筛选、ELISA检测杂交瘤细胞的培养上清液和多次有限稀释克隆化,最终获得两株能稳定分泌抗PF单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为P1E6和P5H10。其次,分别用体外无血清培养和腹水诱生两种方法大量生产单克隆抗体。所得单抗经蛋白质G亲和柱纯化,SDS-PAGE和MALDI-TOF MS检测,MAbs纯度很高,Protein G亲和柱法纯化抗体成功。通过ELISA法对抗体的特性进行测定,腹水抗体效价可达1:256000:两种MAbs的灵敏度分别为0.080μg/ml、0.124μg/ml:P1E6亲和常数是1.819×10-7mol/L,P5H10为2.815×10-7 mol/L;所得两种MAbs具有高度特异性,和PF有强烈的交叉反应,同芍药内酯苷的交叉反应率较低,分别为0.322%、0.524%;与樟脑的交叉反应率为0.018%和0.078%。其他几种结构类似物几乎不与MAbs P1E6和P5H10发生交叉反应。两株MAbs均可用于PF的含量测定和筛选分析。最后,将抗PF的MAbs应用于ELISA分析,建立了直接定量测定样品（赤芍）PF含量的免疫测定方法。结果显示样品的竞争性ELISA检测结果与HPLC的检测结果基本一致,且竞争ELISA比HPLC法的灵敏度高很多。和HPLC相比,新的ELISA分析法更为快速、灵敏、操作简便且重现性良好。它的建立使得大量样品的快速测定成为可能,特别适于有效成分含量极少的样品,可用来定量测定芍药及其复方中药的芍药苷总含量。总之,新建立的竞争ELISA方法可能成为测定不同样品中PF含量的强有力工具,从而对其进行生产质量控制和药理标准化研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 芍药的研究现状
• 1.1 芍药的分类与分布
• 1.2 白芍与赤芍
• 1.3 芍药的化学成分
• 2 我国中药研究的现状与挑战
• 2.1 药用植物的开发利用
• 2.2 复方中药的研究进展与存在问题
• 2.3 中药的质量控制
• 3 单克隆抗体（MAbs）在中药研究中的应用
• 3.1 单克隆抗体的应用优势
• 3.2 单克隆抗体制备的基本原理和流程
• 4 ELISA技术在中药研究中的应用
• 4.1 ELISA的基本原理
• 4.2 ELISA的关键试剂与类型
• 5 研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 主要仪器
• 1.2 主要试剂与材料
• 1.3 常用溶液和培养基的配制
• 2 方法
• 2.1 人工抗原的合成与鉴定
• 2.2 人工抗原PF-HSA的动物免疫
• 2.3 抗Paeoniflorin（PF）单克隆抗体生产流程
• 2.4 抗PF单克隆抗体的特征鉴定
• 2.5 ELISA/HPLC法测定赤芍的PF含量
• 第三章 结果与分析
• 1 PF-载体蛋白偶联效果鉴定
• 1.1 MALDI-TOF MS测定PF-HSA和PF-OVA半抗原数测定
• 1.2 PF-HSA偶联物的紫外吸收光谱鉴定
• 1.3 PF-HSA人工抗原的合成产率
• 2 Balb/c小鼠免疫效果
• 2.1 免疫过程中的血清效价监测
• 2.2 融合前小鼠血清效价
• 2.3 小鼠血清特异性分析
• 3 杂交瘤细胞株的建立
• 3.1 SP2/0骨髓瘤细胞的准备
• 3.2 细胞融合率及抗体阳性率
• 3.3 阳性杂交瘤细胞的筛选、克隆化及建株
• 3.4 抗PF单克隆抗体的大量生产与鉴定
• 4 抗PF单克隆抗体的性质鉴定
• 4.1 Ig类型判断
• 4.2 抗PF MAbs的效价检测
• 4.3 抗PF MAbs的灵敏度与亲和常数测定
• 4.4 抗PF单克隆抗体的特异性分析
• 5 竞争ELISA和HPLC检测结果比较
• 5.1 间接竞争ELISA法测定PF含量
• 5.2 HPLC法测定赤芍中PF含量
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录