丹参酮ⅡA磺酸钠防治脂多糖性急性肺损伤的作用及其机制研究

论文摘要

研究背景:急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）是多种因素引起的以急性肺损伤（acute lung injury,ALI）为特征,并有较高死亡率的疾病。它可导致非心源性呼吸衰竭,目前尚缺乏特异有效的治疗方法。脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）是ARDS的常见致病因素。大量的研究证明,LPS能结合单核/巨噬细胞表面的CD14受体,并与宿主细胞相互作用后使细胞产生大量的细胞因子与炎性介质,其中,磷脂酶A2（phospholipase A2,PLA2）被认为在急性肺损伤的发生发展过程中起了重要作用。PLA2的代谢产物、血小板活化因子（platelet activating factor,PAF）和类花生酸类物质都参与ARDS的形成。丹参酮（tanshinone）具有多种生物活性,如抗肿瘤、抗血栓形成和抗炎等,常在中医中被用来治疗炎性疾病。丹参酮IIA （tanshinone IIA, TIIA）在丹参中含量最多,丹参酮IIA磺酸钠（sodium tanshinone IIA sulphonate,STS）是丹参酮IIA的衍生物。近些年来,许多文献报道丹参酮IIA具有抑制炎性介质与氧自由基释放的作用,但有关其对内毒素引起的ALI的保护作用及其机制的研究比较少。本实验拟观察STS对LPS所致小鼠ALI的预防及治疗作用和对细胞损伤的保护作用,观察STS对内毒素性小鼠死亡率的影响,并进一步研究其发挥作用的可能机制。实验目的: （1）观察STS对LPS导致的ALI的防治作用（2）观察STS对内毒素性小鼠死亡率的影响（3）观察STS是否通过抑制PLA2活力减轻LPS导致的ALI,为STS的临床应用提供理论依据实验方法:动物实验雌性KM小鼠（1822 g）适应环境后,腹腔注射LPS建立小鼠肺损伤模型,随机分为五组:生理盐水（NS）对照组（n = 32）,STS对照组（n = 32）,LPS组（n = 32）,STS+LPS组（n = 32）及LPS+STS组（n = 32）。在NS组、STS组与LPS组,以0.01 ml/g的体积和体重比分别腹腔注射NS、STS（10 mg/kg）和LPS（10 mg/kg）。在STS+LPS组,LPS给予前0.5小时注射STS（10 mg/kg）;在LPS+STS组,LPS注射1小时后给予STS （10 mg/kg）。在NS或LPS注射后6小时取小鼠右肺进行病理观察,测定左肺湿/干重比值（W/D）、左肺/体重比值（L/B）、支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）中蛋白含量、肺组织髓过氧化物酶（MPO）活力、肺组织匀浆与BALF中PLA2活性、BALF中血栓素BB2 （TXB2）含量,以及Westernblotting检测小鼠肺核蛋白中NF-κB的含量以代表其活化程度。为观察STS对动物死亡率的影响,实验动物适应环境后,腹腔注射LPS（50 mg/kg）建立小鼠内毒素血症模型,随机将其分为三组:LPS组（n = 10）,STS+LPS组（预处理组,n = 20）及LPS+STS组（治疗组,n = 20）。在STS+LPS组,LPS给予前0.5小时注射STS（30或50 mg/kg）;在LPS+STS组,LPS注射1小时后给予STS（30或50 mg/kg）。小鼠注射LPS后,每12小时记录一次小鼠的死亡情况,连续记录三天。细胞实验模拟肺环境观察STS对LPS所致的肺上皮细胞损伤的保护作用,肺泡上皮细胞系A549细胞与肺泡巨噬细胞系NR8383细胞分别以1:1或5:1的比例共同培养。用020μg/ml的STS处理24小时,部分细胞在STS预处理2小时后被LPS（1μg/ml）刺激24小时,所有的细胞用PBS洗三次去除NR8383细胞,采用MTT法检测A549细胞的活力;将A549细胞调制浓度为1×106 /ml,并以1:1与5:1的比例与NR8383细胞共同培养,在020μg/ml的STS预处理2小时或未处理的情况下,用LPS（1μg/ml）刺激细胞12小时,测定上清液中LDH的含量。为了探讨STS是否通过直接作用影响PLA2的活性,将NR8383巨噬细胞调制浓度为1×106 /ml接种在24孔培养板,细胞中加入020μg/ml STS,2小时后部分细胞被LPS（1μg/ml）或melittin（一种PLA2激动剂）（3μg/ml）刺激6小时,测定上清中PLA2的活力。实验结果:动物实验形态学观察表明LPS组中肺组织明显充血、水肿并有大量的炎性细胞浸润,而在STS+LPS组及LPS+STS组内毒素所致的肺损伤明显减轻,肺组织结构均趋于正常;W/D、L/B、BALF中蛋白含量与肺匀浆MPO活力在LPS组均较对照组明显升高（P < 0.01）,但在STS+LPS组和LPS+STS组上述指标较LPS组明显减低（P < 0.05）。LPS组小鼠肺匀浆与BALF中PLA2活性为[（49.2±4.3）U与（40.8±6.5）U],均高于正常对照组[（23.8±4.8）U与（27.2±6.9）U],而在STS+LPS组及LPS+STS组分别降至[（29.0±5.8）U,（30.0±5.8）U]与[（31.4±4.9）U,（31.0±3.8）U],与LPS组相比有统计学差异。LPS组小鼠BALF中TXB2含量高于正常对照组（P < 0.01）;而在STS+LPS组及LPS+STS组降低,与LPS组相比有统计学差异（P < 0.01）。Western blotting结果显示LPS能显著增加胞核中NF-κB的含量,表明NF-κB活化;而在STS+LPS组及LPS+STS组其活化明显降低。30或50mg/kg STS预处理组小鼠3天死亡率分别为50%和40%,比LPS组（80%）显著降低（P < 0.05）;STS预处理组小鼠的生存时间分别为（50.3±7.19）h与（51.62±7.89）h,比LPS组（32.80±6.30）h显著延长（P < 0.05）。但是,LPS注射后给予30或50 mg/kg的STS治疗并不能显著降低小鼠的死亡率（70%）,也不能明显延长其生存时间。细胞实验MTT结果显示020μg/ml的STS对A549细胞的活力没有影响,1μg/ml的LPS显著降低其活力（P < 0.01）,STS能浓度依赖性地逆转LPS导致的细胞活力的下降;LPS能增加上清中LDH含量,STS同样浓度依赖性地抑制LPS导致的LDH含量的升高。在NR8383细胞中,STS本身对PLA2的活力没有影响,LPS和melittin都使PLA2活力显著升高（P < 0.01）。不同浓度的STS均能抑制LPS所致的PLA2活力的增高,而且具有剂量依赖性。但是不同浓度的STS对melittin所致的PLA2活力的增高没有影响。结论: （1） STS对LPS导致的小鼠急性肺损伤有预防和治疗作用。（2） STS对LPS所致的肺泡上皮细胞损伤具有保护作用。（3） STS虽然不能逆转内毒素导致的小鼠死亡,但STS预处理能降低小鼠的死亡率并能显著延长动物的平均生存时间。（4） STS对LPS所致急性肺损伤的保护作用与其抑制肺中PLA2活性有关。（5） STS对PLA2活力的抑制不是通过直接作用,可能通过抑制NF-κB的活化间接发挥作用的。

论文目录

缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

正文

第一部分 STS对LPS性急性肺损伤的防治作用

1 动物实验

1.1 材料

1.2 实验方法

1.3 实验结果

2 细胞实验

2.1 材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果

3 讨论

第二部分 STS对LPS所致小鼠死亡率的影响

1 材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第三部分 STS防治LPS性急性肺损伤的机制研究