论文摘要
肥胖症,是机体代谢异常而导致体内脂肪过度积累的一种慢性疾病,肥胖症的发生会增加心血管疾病、代谢综合征和2型糖尿病的罹患风险。机体脂肪细胞通过成纤维细胞样前体脂肪细胞分化而来,前体脂肪细胞过度分化或者脂肪细胞体积增大与肥胖症的发生发展紧密相关。生长激素（growth hormone, GH）,由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌,是分子量为22kDa的单一肽链蛋白质激素,它是一种多功能的生长、代谢调节激素。GH与其受体二聚体结合,激活JAK2,引发一系列信号通路。信号转导与转录因子STAT5是GH下游信号分子,其两个亚型STAT5A及STAT5B分别由不同基因编码,然而两者高度同源,可高达96%。转基因动物实验研究表明：生长激素受体缺失了STAT5活化的序列可导致动物体型变小及肥胖。STAT5B在GH信号通路中发挥重要作用,然而其在脂肪分化过程中的作用及其对脂肪积累的机制并不明确,阐明其相应机制可为防治肥胖提供较好的理论基础,也可为新药的发现提供很好的线索。生长激素与胰岛素在机体生长发育及代谢中都发挥重要的作用,在整个机体中,这两种激素协调作用以维持机体代谢的平衡。生长激素与胰岛素的信号途径中都有P13K及ERK两种通路,而生长激素还有STAT5途径。这两种激素在脂肪细胞中有什么样的协同作用或抑制作用有待于去探索。本课题的工作分以下三部分开展：第一部分生长激素对成熟3T3-F442A脂肪细胞基因表达的影响研究目的：探讨生长激素对成熟脂肪细胞基因表达的影响研究内容：1.诱导脂肪前体细胞3T3-F442A分化成脂肪细胞,用油红O染色法鉴定脂肪细胞内甘油三酯的存在,并以异丙醇萃取法对油红O着色的甘油三脂在490nm波长处进行定量；2.显微观察并收集各分化时期细胞样本。检测脂肪细胞分化过程中分化标志分子（如PPARγ、C/EBPβ、FAS等）的mRNA转录水平及蛋白质表达水平；3.对分化成熟的3T3-F442A脂肪细胞进行生长激素干预（对照组用PBS）,对其mRNA进行Microarray分析,从而找到差异表达基因并对其结果进行RT-PCR验证；4.用125ng/mL的生长激素剂量对成熟3T3-F442A脂肪细胞刺激24h及48h（对照用等体积PBS刺激细胞）,然后检测SOCS家族、脂联素及其受体mRNA表达水平；5.用125ng/mL的生长激素剂量对成熟3T3-F442A脂肪细胞刺激24h及48h（对照用等体积PBS刺激细胞）,运用Real-Time PCR技术,检测脂肪合成及分解相关基因的mRNA水平；6.用125ng/mL的生长激素剂量干预3T3-F442A前脂细胞诱导分化过程（对照用等体积PBS干预细胞）,于分化不同时段（0-12天）收集RNA,检测脂肪形成标志基因、脂肪合成相关酶类的表达水平。研究结果：1.3T3-F442A脂肪前体细胞经过体外诱导,细胞形态逐渐变圆,胞浆内脂滴出现并逐渐变大增多,油红O染色逐渐明显,油红O染色萃取液的OD490nm值逐渐增大,诱导至第12天后可见90%以上细胞呈脂肪细胞表型、大量脂滴聚积,确定成功建立脂肪细胞诱导模型。2. RT-PCR和Western Blot检测结果发现在脂肪细胞诱导分化过程中PPARγ mRNA及蛋白质表达水平随分化程度的增强逐渐升高,与未分化细胞（诱导分化第0天）相比较,自诱导分化第4天始,在每个时间点皆呈明显升高,且差异具有统计学意义（p<0.05）。C/EBPβ、FAS基因表达水平经诱导分化显著升高。3. Microarray分析结果表明：500ng/mL生长激素处理成熟3T3-F442A脂细胞24h后Adipor2及SOCS2两个基因表达水平较对照组明显上调。此结果为RT-PCR所证实。4.与对照组（PBS组）细胞相比,成熟3T3-F442A脂肪细胞经125ng/mL生长激素分别处理24h及48h后,IGF-I mRNA表达水平均上调；生长激素不改变Leptin的表达；SOCS家族CIS、SOCS1、SOCS3受GH刺激24h表达水平均升高,48h后有所回调；Adiporl在生长激素刺激24h时表达升高2.5倍；说明生长激素可调节成熟3T3-F442A脂肪细胞内一些分子的表达。5.生长激素下调了成熟3T3-F442A脂肪细胞中FAS、FABP、PPARγ的表达水平,而不改变C/EBPp基因的表达；也不改变脂肪分解相关基因HSL、ATGL、UCP1表达；提示GH影响脂肪细胞合成活动。6.生长激素对3T3-F442A前脂细胞分化过程的干预结果表明：脂肪合成标志基因及合成酶类表达受GH干预下调,但GH未能抑制脂肪细胞的分化,可见GH阻碍脂肪细胞分化程度但不改变分化进程。研究结论：1.3T3-F442A前体脂肪细胞可在体外诱导分化为成熟脂肪细胞,造模成功。2. Microarray检测结果表明生长激素在成熟脂肪细胞可提高SOCS家族及脂联素受体的表达。3.生长激素在3T3-F442A脂肪前体细胞体外诱导分化过程中,发挥一定程度的抑制分化的作用,但无法阻止诱导分化进程。第二部分STAT5B分子在脂肪细胞分化中的作用研究目的：探讨shRNA敲低STAT5B的表达在前体脂肪细胞3T3-L1体外分化进程中作用。研究内容：1.分别检测STAT5A及STAT5B在3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化过程中mRNA水平；2.设计靶向小鼠STAT5B基因的shRNA序列,构建重组慢病毒载体LV3-STAT5B-shRNA,以慢病毒LV3-NC为阴性对照,经293T细胞包装病毒后感染脂肪前体细胞3T3-F442A,筛选出3T3-L1稳转STAT5B敲低（Knockdown）的细胞群（KD）及阴性对照单细胞群（NC）；3.对筛选所得稳转STAT5B KD细胞及NC细胞进行诱导分化,分别于分化不同时期提取RNA（D0, D2, D4, D6, D8, D10, D12）,检测样本中脂肪分化标志基因、脂肪合成相关酶类及脂分解相关酶的mRNA水平；4.在诱导培养基中添加125ng/mL剂量的生长激素以干预KD及NC两种稳转细胞群的分化过程,在分化不同时段提取RNA,检测样本中脂肪分化标志基因、脂肪合成相关酶类及脂分解相关酶的mRNA水平。研究结果：1.在脂肪细胞诱导分化过程中,STAT5A及STAT5B mRNA表达水平随细胞分化程度的增强逐渐升高。与未分化前（D0）比较,3T3-L1前脂细胞诱导分化第2天STAT5B基因表达即明显升高,且分化过程中稳定表达。2.对筛选出的STAT5B KD及NC3T3-L1脂肪前体单克隆细胞进行RT-PCR和Western Blot检测,结果表明所选STAT5B-shRNA序列能够有效干扰STAT5B mRNA及蛋白质的表达,分别降低至30%及10%。3.体外诱导分化实验结果表明：干扰STAT5B表达降低了脂肪细胞分化标志基因的表达；与分化同期对照组细胞（NC）比较,敲低STAT5B表达组细胞（KD）在诱导分化过程中PPARα、PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ等mRNA表达水平明显下调（p<0.05）。4.体外诱导分化实验结果还表明：与对照（NC）细胞比较,KD细胞脂肪合成相关酶类,如脂肪酸合成酶（FAS）、脂肪酸结合蛋白（FABP）的表达水平下降。乙酰辅酶A羧化酶（ACC）表达两组无明显差异。5.生长激素干预降低了KD及NC两组细胞脂肪合成关键性调节因子及脂肪合成相关基因的表达水平,但GH干预对NC组的蛋白表达所致之降低更为明显。6.生长激素干预在3T3-L1前脂细胞分化中上调了ATGL的表达；生长激素作用大幅上调了NC细胞中UCP1的表达,而未改变KD细胞中UCP1的表达。研究结论：1.在3T3-L1前体脂肪细胞的体外分化过程中,STAT5B呈现升高趋势。2.敲低3T3-L1前体脂肪细胞中STAT5B基因的表达,其分化过程中关键性酶及分子的表达水平受到影响。3.在前脂细胞分化过程中,因生长激素的干预作用使PPARα、PPARγ、C/EBPα、 C/EBPβ、FAS及FABP六种与脂肪形成相关的基因表达下调。4.在前脂细胞分化过程中,因生长激素的干预作用使得ATGL基因的表达上调,也使UCP1基因的表达大幅上调,这种上调在STAT5B敲低的细胞中未得到体现,提示这种表达上调是STAT5B依赖性的。第三部分胰岛素/IGF-I对生长激素STAT5信号通路的影响研究目的：探讨胰岛素对生长激素在成熟3T3-F442A脂肪细胞中信号通路的影响研究内容：1.以系列浓度（0、5、25、50、125ng/mL）生长激素刺激3T3-F442A成熟脂肪细胞,检测STAT5及MAPK信号的磷酸化程度；2.以200nM胰岛素及100ng/mL IGF-I刺激3T3-F442A成熟脂肪细胞模型,运用Western Blot技术检测STAT5及MAPK信号通路的活化程度；3.用胰岛素与系列浓度生长激素共同作用脂肪细胞10min及胰岛素预处理20min后再与系列浓度生长激素共同作用10min,检测胰岛素对生长激素信号通路分子STAT5及MAPK磷酸化影响；4.用IGF-I与生长激素共同作用分化成熟的脂肪细胞10min及IGF-I预处理20min后再与生长激素共同作用10min,检测信号通路分子STAT5及MAPK磷酸化变化；5.在C57/BL6小鼠腹腔体内注射生长激素及胰岛素,取肾周脂肪组织提取蛋白质,检测动物脂肪中胰岛素对生长激素信号分子STAT5及MAPK活化的影响。研究结果：1.在成熟3T3-F442A脂肪细胞中,生长激素诱导STAT5磷酸化水平及MAPK磷酸化水平与生长激素均呈剂量及作用时间效应关系。2.胰岛素或IGF-I刺激3T3-F442A脂肪细胞不诱导STAT5酪氨酸磷酸化；但可诱导MAPK的酪氨酸磷酸化。3.细胞及动物实验均表明：胰岛素可增强生长激素诱导的STAT5磷酸化水平,提示胰岛素与生长激素共同作用可提高生长激素对STAT5活化的程度。4. IGF-I也可增强生长激素诱导STAT5磷酸化水平,提示IGF-I有与胰岛素类似的效应,即与生长激素共同作用而促进了STAT5的活化水平。研究结论：1.生长激素特异性活化3T3-F442A成熟脂肪细胞内JAK-STAT5信号通路,而胰岛素及IGF-I不引起此通路的活化；2.细胞及动物试验均表明：胰岛素增强了生长激素活化STAT5的程度,提示胰岛素与生长激素可能在成熟脂肪细胞内协同调节特定的生理功能。3. IGF-I与胰岛素有相近的信号通路,本课题发现IGF-I也可增强生长激素对STAT5信号通路的活化程度。4.生长激素的STAT5途径有利于抑制脂肪的积累,而胰岛素则有利于前脂肪细胞的分化、脂肪的积累。我们的观察表明,胰岛素与生长激素共同存在时,可促进生长激素引发的STAT5途径,这可为人们使用生长激素干预肥胖提供了一些理论依据。
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