北京油鸡细菌人工染色体文库的构建与肉质风味相关基因的研究

论文摘要

为了有效保存我国优质肉鸡品种资源——北京油鸡,本研究构建了北京油鸡细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome）文库,并将ATIC（aminoimidazole carboxamide ribonucleotide transformylase and IMP cyclohydrolase）基因和L-FABP（liver fatty acid-binding protein）基因作为影响鸡肉质和风味的相关基因,对基因的结构、在体外成纤维细胞中的表达及亚细胞定位进行了研究,同时获得了稳定表达ATIC基因的阳性克隆细胞株。本研究抽取雌性北京油鸡静脉血,用于制备大分子量基因组DNA,制备好的基因组DNA经HindⅢ部分酶切后,二次脉冲电泳分离所需DNA片段。电洗脱回收100～400kb范围的片段,与pBeoBAC11载体连接,转化DH10B感受态细胞,挑取和保存白色单克隆。本研究所构建北京油鸡基因组BAC文库,含有115,200个BAC克隆（保存在30个超级池,每个超级池由10个384孔板组成）。随机挑选了200个BAC克隆的插入片段进行估计,平均大小为158kb,其中空克隆的比例为0.9%,表明文库的覆盖率为13.7倍,预计从文库中筛选到单拷贝基因的机率为99.99%。文库中70%的克隆插入大于100kb,而且有部分克隆甚至大于300kb,这样大小的插入可以满足所有试验对于片段大小的要求。本研究取北京油鸡鸡胚和阿勒泰羊的耳缘组织,通过组织块贴壁培养法,成功构建了北京油鸡和阿勒泰羊的成纤维细胞系,并对所建细胞系进行了各项生物学特性检测,同时对绿色荧光蛋白基因转染成纤维细胞的各项影响因素进行了研究。结果表明,细胞系的各项指标均达到美国典型培养物中心（American type Culture Collection, ATCC）细胞系鉴定标准,为研究外源基因在成纤维细胞中的表达与调控提供了优质的靶细胞。本研究提取北京油鸡心、肝、脾、肺、肾、脑、腿肌与胸肌等不同组织的总RNA,利用RT-PCR方法扩增得到L-FABP基因,并检测ATIC基因mRNA在不同组织中的差异表达水平。将ATIC基因完整开放阅读框重组至真核表达载体pDsRed1-N1, pEYFP-N1及pEGFP-N3的多克隆位点EcoR I和BamH I之间,将L-FABP基因完整开放阅读框重组至pEGFP-N3的多克隆位点XhoI和EcoRI之间,成功构建带有报告基因的真核重组表达载体pDsRed1-N1-ATIC, pEYFP-N1-ATIC, pEGFP-N3-ATIC和pEGFP-N3-L-FABP。采用脂质体介导法,将pDsRed1-N1-ATIC、pEYFP-N1-ATIC和pEGFP-N3-ATIC导入北京油鸡体外培养成纤维细胞中,将pEGFP-N3-L-FABP导入阿勒泰羊体外培养成纤维细胞中。对ATIC基因和L-FABP基因在细胞中的表达、亚细胞定位、阳性细胞生长与增殖状况进行了研究,并利用G418药物筛选和进行单克隆化培养。结果发现,在转染后24h、48h和72h,各个重组融合蛋白的转染率在10.3%～53.2%之间。重组融合蛋白在北京油鸡和阿勒泰羊成纤维细胞的细胞核与细胞质均分布,但主要集中在细胞核周围。经RT-PCR扩增确认ATIC融合蛋白基因整合到北京油鸡成纤维细胞的基因组中,L-FABP融合蛋白也整合到阿勒泰羊成纤维细胞的基因组中,Western blot检测验证发现ATIC融合蛋白在北京油鸡成纤维细胞的基因组中获得正常表达。经药物筛选和单克隆化培养,获得了表达pDsRed-N1-ATIC,pEYFP-N1-ATIC与pEGFP-N3-ATIC融合蛋白的阳性克隆细胞株。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 畜禽种质资源的现状与保存
• 1.1.1 国内外畜禽种质资源概况
• 1.1.2 畜禽种质资源保存技术
• 1.2 鸡的基因组研究
• 1.2.1 物理图谱
• 1.2.2 遗传连锁图谱
• 1.2.3 物理图谱和遗传连锁图谱的综合
• 1.2.4 表达序列标签
• 1.2.5 比较基因组
• 1.3 细菌人工染色体（BAC）研究现状
• 1.3.1 基因组文库概述
• 1.3.2 BAC 的构建和发展
• 1.3.3 BAC 基因组文库的应用
• 1.3.4 BAC 文库的参数
• 1.4 北京油鸡肉质风味基因研究现状
• 1.4.1 北京油鸡ATIC 基因的研究进展
• 1.4.2 北京油鸡L-FABP 基因的研究进展
• 1.5 本研究的目的及意义
• 第二章 北京油鸡细菌人工染色体文库的构建和鉴定
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要药品和酶
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 常规溶液及试剂配制
• 2.1.4 实验动物
• 2.1.5 菌株与克隆载体
• 2.1.6 文库构建试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 基因组大片段制备
• 2.2.2 BAC 质粒载体的制备
• 2.2.3 电击感受态细胞的制备（DHl0B）
• 2.2.4 基因组DNA 和载体DNA 的连接
• 2.2.5 电转化
• 2.2.6 文库的保存管理
• 2.2.7 文库插入片段长度的鉴定
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 基因组大片段制备
• 2.3.2 BAC 载体的制备
• 2.3.3 连接与转化
• 2.3.4 北京油鸡BAC 文库的鉴定
• 2.4 讨论
• 2.4.1 高分子量DNA 的制备技术
• 2.4.2 BAC 载体制备技术
• 2.4.3 载体与高分子量DNA 的连接
• 2.4.4 电激转化技术
• 2.4.5 BAC 文库的鉴定
• 第三章 北京油鸡和阿勒泰羊转基因靶细胞的制备与检测
• 3.1 材料
• 3.1.1 实验动物
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要溶液配制
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 细胞培养
• 3.2.2 细胞生物学特性检测
• 3.2.3 脂质体介导荧光蛋白转染靶细胞
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 北京油鸡和阿勒泰羊转基因靶细胞系的制备
• 3.3.2 北京油鸡和阿勒泰羊转基因靶细胞系质量的检测
• 3.3.3 脂质体介导荧光蛋白转染靶细胞
• 3.4 讨论
• 3.4.1 细胞培养方法
• 3.4.2 核型分析
• 3.4.3 同工酶分析
• 3.4.4 外源基因在细胞中的表达
• 第四章 北京油鸡ATIC 和L-FABP 基因的研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 实验动物
• 4.1.2 质粒与菌株
• 4.1.3 主要试剂及配置
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 总RNA 的抽提
• 4.2.2 RT-PCR 扩增cDNA
• 4.2.3 L-FABP 目的片段的获取
• 4.2.4 北京油鸡ATIC 基因在体内的表达研究
• 4.2.5 目的基因的克隆
• 4.2.6 北京油鸡ATIC 基因和L-FABP 基因真核表达载体的构建
• 4.2.7 脂质体介导外源基因转染靶细胞
• 4.2.8 G418 筛选抗性细胞
• 4.2.9 克隆化阳性细胞株中荧光蛋白基因和目的基因的检测
• 4.2.10 Western blot 检测靶细胞中重组蛋白的表达
• 4.3 结果
• 4.3.1 不同组织、器官总RNA 的提取
• 4.3.2 北京油鸡ATIC 基因体内表达情况和L-FABP 基因片段的获取
• 4.3.3 北京油鸡ATIC 和L-FABP 基因序列分析
• 4.3.4 真核表达载体的构建
• 4.3.5 ATIC 基因和L-FABP 基因在靶细胞中的表达
• 4.3.6 ATIC 基因和L-FABP 基因在靶细胞中的定位
• 4.3.7 克隆化细胞株的筛选及鉴定
• 4.3.8 Western blot 检测成靶细胞中重组融合蛋白的表达
• 4.4 讨论
• 4.4.1 ATIC 基因和L-FABP 基因
• 4.4.2 影响转染的各种因素
• 4.4.3 亚细胞定位
• 4.4.4 阳性细胞株的建立与筛选
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介