论文摘要
虽然体外循环（cardiopulmonary bypass,CPB）技术取得长足进步,但因为接受开胸心脏手术的患者数量及手术难度均呈增加趋势,并且越来越多的老年以及有合并症的患者接受手术,体外循环后脏器功能损伤仍广泛存在。对体外循环损伤机制及器官保护的研究也越来越多,大量的体外循环临床前研究需要简单、经济、可靠的动物模型。大动物模型虽然能比较完整地复制临床体外循环过程,但操作比较复杂且实验花费高昂。本实验在我们既往研究的基础上进行多方面的改进,建立起一个微创大鼠体外循环模型,并研究了在特定体外循环条件下大鼠肾损伤特点以及可能的机制,探讨该动物模型是否可以作为研究体外循环后肾脏损伤的可靠模型。过氧化物酶增殖体激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR）属核受体超家族成员,分α、β和γ三种亚型。PPAR激活在生理病理状态下具有多种作用,如调节糖、脂肪代谢,参与调节细胞分化、恶性肿瘤的形成;具有抗炎、调节免疫和抗增殖活性的作用等。既往的研究证实,PPAR激动剂能保护糖尿病、高血压及其他多种疾病导致的慢性肾功能损伤,另外在缺血再灌注、肾毒性药物等多个肾损伤动物模型中亦体现出肾功能保护作用。PPAR激动剂可以减少体外循环所致的心肌细胞凋亡并保护心功能,但PPAR激动剂在体外循环后肾功能损伤方面的研究未见报道。我们通过喂饲大鼠PPAR-γ激动剂吡格列酮后行体外循环实验,以明确PPAR激动剂在大鼠体外循环模型中是否具有肾脏保护作用,并探讨可能的机理。第一部分微创大鼠体外循环模型的建立及其肾损伤目的建立微创大鼠体外循环模型,研究在特定体外循环条件下大鼠肾损伤特点以及可能的机制,探讨该动物模型是否可以作为研究体外循环后肾脏损伤的可靠模型。材料和方法成年SD大鼠80只,每组10只随机分入8组,分别为:假手术组、CPB结束时、CPB后2小时、6小时、12小时、24小时、48小时和96小时。CPB大鼠麻醉后穿刺左侧股动脉、右侧颈外静脉和尾动脉分别用于动脉压监测、静脉引流和动脉灌注,连接各预充的体外循环管路接受60分钟体外循环,最大流量100ml/Kg/min。假手术组麻醉插管,但不实施CPB。监测CPB前后大鼠血压、心率、体温、血气、酸碱电解质。按不同分组在各时间点处死大鼠,剖腹经腹主动脉采血1.5ml,直视下膀胱穿刺抽取尿液1～1.5ml,取双侧。肾脏,一侧以10%甲醛溶液固定行组织学检查,另一侧置于液氮中保存用以检测蛋白含量。从血清肌酐、尿中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白（neutrophilgelatinase-associated lipocalin,NGAL）和肾脏组织形态学变化等三方面评价各组大鼠肾功能损伤,检测血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、组织TNF-α、核因子-κB（NF-κB）、髓过氧化物酶（MPO）、丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化歧化酶（SOD）、还原性谷胱甘肽（GSH）,评价大鼠全身和肾脏组织炎症反应以及氧化应激。以SPSS 13.00行统计学分析,p＜0.05认为差异具有统计学意义。结果所有大鼠顺利完成插管及体外循环,均存活至设定的实验终点。在体外循环中大鼠血压、心率、体温、红细胞比容、动脉血氧分压PaO2和pH值较体外循环前显著改变,体外循环结束后各生理数据逐步恢复,但术后2小时包括血压、心率、体温、红细胞比容和pH等仍较术前基础值有统计学差异。经历体外循环后,大鼠肾功能受损,血清肌酐值升高,在术后12小时与术前值有统计学差异,48小时达到峰值;尿NGAL在术后2小时即显著上升,术后12小时达到峰值。体外循环后,大鼠近曲小管上皮变性,有灶性脱落,上皮细胞肿胀或空泡变性,大部分小管刷状缘消失,远曲小管形态尚好,可见蛋白管型和白细胞浸润以及凋亡。体外循环后大鼠血清TNF-α明显高于假手术组,同时反映炎症反应和氧化应激水平的肾组织内TNF-α、NF-κB、MPO、MDA表达增高,大多在体外循环后6～24内达到高峰。相对应的反映组织还原性的CAT、SOD、MDA则均在体外循环后均下降,而在体外循环后48小时开始恢复,但至实验结束亦未能恢复至术前值。结论1、本研究建立的微创大鼠体外循环模型具有经济、简单、微创、体外循环参数设置接近临床、成功率高、生存期长等优点。可以作为部分研究体外循环实验的可靠的动物模型。2、在设定的体外循环条件下大鼠出现肾功能损伤,该损伤是可以自行恢复的。3、体外循环后大鼠出现全身和肾脏组织局部的炎症反应和氧化应激,可能在肾功能损伤过程中起到一定作用。4、相对于血清肌酐,尿NGAL是一个更早期、敏感、特异的肾脏损伤标志。第二部分PPAR-γ激动剂对体外循环大鼠肾脏保护作用及机理研究目的应用第一部分建立的动物模型,研究PPAR-γ激动剂吡格列酮对体外循环所致大鼠肾功能损伤是否具有保护作用,并探讨可能机制。材料和方法成年SD大鼠30只,每组10只随机分入3组:假手术组、对照组和PPAR组。术前1周起,大鼠连续7天用灌胃针经口按20mg/kg体重剂量给予吡格列酮溶液,假手术组和对照组经灌胃针给予生理盐水2ml。对照组和PPAR组麻醉插管后接受60分钟体外循环,最大流量100ml/Kg/min。假手术组行类似操作,但不实施体外循环。实验前后监测平均动脉压、心率、体温、红细胞比容和氧分压。于肝素化后转流前（T1）、转流结束后（T2）、术后2小时（T3）以及术后12小时（T4）采集血液标本,检测血清肌酐和TNF-α;于术后12小时将大鼠处死,剖腹经腹主动脉采血1.5ml,直视下膀胱穿刺抽取尿液1～1.5ml,取双侧肾脏,一侧以10%甲醛溶液固定行组织学检查,另一侧置于液氮中保存用以检测蛋白含量。从血清肌酐、尿NGAL和肾脏组织形态学变化等三方面评价三组大鼠肾功能损伤程度。PPAR-γ活化以免疫组化方法检测。检测血清TNF-α、组织TNF-α、NF-κB、MPO、MDA、CAT、SOD、GSH,评价三组大鼠全身和肾脏组织炎症反应以及氧化应激水平。以SPSS 13.00行统计学分析,p＜0.05为差异显著。结果所有大鼠顺利接受手术,存活至实验终点。接受体外循环的大鼠手术过程中的血压、心率、体温、红细胞比容、氧分压和pH值与假手术组相比均有显著差异,而对照组和PPAR组之间上述指标无显著差异。对照组和PPAR组血清肌酐值在手术结束和手术后2小时显著低于假手术组;术后12小时时三者肌酐值对照组＞PPAR组＞假手术组,但三者差异却无统计学意义。对照组和PPAR组术后12小时尿NGAL水平均显著高于假手术组,但PPAR组显著低于对照组。相比于假手术组,对照组和PPAR组均表现出一定程度的组织学损伤,PPAR组的肾组织损伤评分和凋亡系数均显著低于对照组。体外循环后对照组在各时间点血清TNF-α显著高于假手术组,PPAR组血清TNF-α值虽高于假手术组,却显著低于对照组。经历体外循环后肾组织中炎症反应的指标如TNF-α、NF-κB、MPO以及氧化应激的指标MDA,在对照组普遍升高,在PPAR组中虽也升高却显著低于对照组升高幅度;而组织中还原型物质在PPAR组却显著高于对照组。显示PPAR可以减轻炎症反应和氧化应激水平。结论1、大鼠经历体外循环后发生肾功能损伤,全身和肾脏组织中出现炎症反应激活和氧化应激。2、PPAR激动剂吡格列酮具有减轻体外循环所致肾功能损伤的作用。3、吡格列酮保护肾功能的作用可能部分与其减轻炎症反应和氧化应激有关。