仙客来体细胞胚胎的发生、变异及其蛋白质组学研究

论文摘要

仙客来（Cyclamen persicum Mill.）是一种重要的观赏花卉,研究表明通过器官发生途径或体胚发生途径繁殖,后代都存在变异现象。为了揭示体胚发生机制和体胚变异的原因,提高快速繁殖效率,本研究对仙客来体细胞胚胎发生的条件、生物学特性和蛋白质组学进行了研究,主要结果如下:以仙客来种苗为试材,接种于不同浓度激素组合的1/2MS培养基上,结果表明球茎是较好的诱导胚性愈伤的材料,1/2MS+6-BA0.2mg/L+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5 g/L+肌醇100mg/l+酪蛋白100mg/l是较好的诱导条件。此结果为仙客来体胚变异和发生机制的研究提供了实验基础,同时为其快速繁殖奠定了技术基础。为获得大量且一致的体细胞胚胎,对仙客来的愈伤组织进行了悬浮培养,分别建立了胚性和非胚性细胞悬浮培养体系。确定了胚性细胞悬浮培养体系的最适初始细胞浓度和生长周期,分别为PCV 8%和两周,同时发现非胚性细胞悬浮培养体系的生长周期与初始浓度有关。以仙客来胚性愈伤和不同时期体胚为材料,进行了细胞学和组织学研究。结果表明,胚性细胞多分布于愈伤组织的表层,少量胚性细胞团分布于深层,由非胚性细胞包围。表层体胚的发生存在单细胞起源和可能的多细胞起源,单细胞起源的原胚有胚柄,分别依次经过多细胞原胚、球形胚、鱼雷形胚发育阶段。对仙客来的胚性愈伤进行固体培养基培养和液体悬浮培养,分别获得了大量体胚,依据体胚萌发后的状态不同进行统计,固体培养基上得到10.9%的正常体胚,其体胚变异机率为89.1%,悬浮培养得到6.25%的正常体胚,变异机率为93.75%。对不同类型的体胚进行组织学观察,结果表明,仙客来体胚存在的变异可能是由于胚胎的极性异常所致。为更好的理解仙客来胚胎的发育途经及体胚变异的原因,通过对不同发育时期的体胚与合子胚进行组织学观察,比较了仙客来体胚与合子胚的发育过程。结果表明,二者发育途径基本一致,都经过球形胚和鱼雷胚时期、有一片子叶,不同的是合子胚形成的同步化程度高,同时伴随着发达的胚乳的形成;体胚的变异可能在初期胚母细胞时期就有表现。随着愈伤组织继代次数的增加,变异的机率加大,为减少变异,对仙客来愈伤组织进行了超低温冷冻保存研究。以继代后处于对数生长期的愈伤组织为实验材料,首先在含有不同蔗糖浓度的培养基上预培养不同时间,转至不同的冰冻保护剂中直接液氮冷冻或-20℃预冷冻2小时,然后液氮超冷冻保存,37℃水浴迅速解冻,并用相应蔗糖浓度的液体培养基洗涤,以中性红染色测定细胞的存活率,SPSS13.0软件进行统计学分析。结果表明,预培养基中蔗糖浓度、预培养时间、降温方式、冷冻保护剂对解冻后材料相对存活率存在不同程度的影响,最终筛选出4%蔗糖浓度预培养3天、0℃停留30分钟后直接冷冻、9号保护剂为超低温保存的最佳方案。选择正常成熟的鱼雷体胚作为试验材料,研究了植株的再生,其萌发率高达90%,萌发后由于新生真叶叶柄嫩、脆,容易导致伤亡,造成成苗率下降。为了解仙客来体胚发生的调控机制,对体胚发生的蛋白质组进行分析。应用Imagemaster软件分析了体胚（球形胚和鱼雷胚）和对照组（合子胚、萌发胚、非胚性愈伤）的2-DE图谱,分别检测到451、460、360、662、340个蛋白点。通过比较体胚和对照组高丰度的蛋白点,发现在仙客来体胚发生中至少存在35个差异表达的蛋白质。其中5个在球形胚和鱼雷胚中同时出现且稳定表达,13个在鱼雷胚中上调,9个在鱼雷胚中下调,8个是鱼雷胚新出现的蛋白质,推测仙客来体胚的发生和体胚的成熟有特异的蛋白来调控。选择其中12个有代表性的蛋白点（1个稳定表达蛋白、7个上调蛋白、3个下调蛋白、1个新蛋白）胰酶消化后进行MALDI-TOF-MS分析,初步鉴定4个,其余进行MALDI-TOF-TOF-MS分析,初步鉴定6个。采用蛋白质组学的方法和技术,对仙客来的变异体胚进行了较初步的蛋白质组图谱分析。通过比较正常体胚与变异体胚的蛋白2-DE图谱,发现有6个蛋白点为B型（仅有芽分化）和D型体胚（没有芽和根的分化）缺失的点,而C型（仅有根的分化）存在这6个蛋白点,表明这些蛋白点可能与胚根的分化有关。7个为C型和D型缺失的点,而B型存在,表明这些蛋白可能与胚芽的分化有关系。D型除了缺失上述13个点之外,还缺失3个点,表明这三个点的基因可能同时调控胚根和胚芽的分化。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 植物体细胞胚胎的概述
• 2 体胚发生及生理生化反应
• 2.1 体胚发生的诱导因素
• 2.1.1 植物基因型和外植体类型
• 2.1.2 培养基和外源激素
• 2.2 体胚发生的发育方式
• 2.3 体胚发生的生理生化反应
• 3 体胚发生的蛋白质研究
• 3.1 特异蛋白的比较分析
• 3.1.1 1-D 和2-D 凝胶电泳比较分析
• 3.1.2 同功酶的比较
• 3.2 标记蛋白抗体-单克隆抗体
• 3.3 体胚发生的胞外蛋白
• 3.4 结论
• 4 体胚发生基因的选择性表达
• 4.1 体胚发生机理研究的重要性及特异基因类型
• 4.2 体胚发生的诱导机制——胁迫和激素
• 4.2.1 胁迫启动基因的表达
• 4.2.2 生长素诱导基因
• 4.2.3 ABA 诱导基因
• 4.3 体胚发生主要的调控基因
• 4.3.1 持家基因
• 4.3.2 细胞周期基因
• 4.3.3 体胚发生激酶受体基因
• 4.3.4 其它基因
• 4.4 细胞信号传导与体胚发生
• 2+信号系统'>4.4.1 体胚发生中的Ca²⁺信号系统
• 4.4.2 体胚发生与钙调蛋白
• 4.5 cDNA 差异筛选与mRNA 差异显示—体胚发生目的基因的分离
• 4.5.1 cDNA 差异筛选
• 4.5.2 差异显示
• 4.6 结论
• 5 仙客来体胚发生的研究进展
• 5.1 胚性愈伤的诱导
• 5.1.1 外植体
• 5.1.2 激素
• 5.1.3 其他影响因素
• 5.1.4 胚性愈伤与非胚性愈伤
• 5.2 多细胞原胚的增殖
• 5.3 体细胞胚的同步化与萌发
• 5.3.1 体细胞胚的同步化
• 5.3.2 体细胞胚的萌发
• 5.3.3 影响体细胞胚发生的因素
• 5.3.4 ABA 对体胚成熟的影响
• 5.4 植株再生
• 5.5 其他方面的研究
• 5.5.1 仙客来体胚发生的分子生物学研究
• 5.5.2 仙客来胚性细胞和体胚的保存
• 5.5.3 仙客来人工种子的制作
• 5.5.4 生物反应器的应用
• 5.6 结束语
• 5.6.1 发育机制的研究
• 5.6.2 人工种子的规模化生产
• 6 研究目的、意义和内容
• 6.1 研究目的和意义
• 6.2 研究内容
• 6.3 技术路线
• 6.3.1 体胚发生及体胚变异的研究
• 6.3.2 蛋白质组学研究
• 第二章 仙客来体细胞胚胎的发生及变异
• 1. 仙客来胚性愈伤组织的诱导及体胚发生
• 1.1 材料和方法
• 1.1.1 材料
• 1.1.2 方法
• 1.2 结果与分析
• 1.2.1 初培养与细胞形态特征
• 1.2.2 2,4-D 与NAA 对愈伤组织的影响
• 1.2.3 球茎与叶柄对愈伤组织的影响
• 1.2.4 2,4-D 浓度对愈伤组织的影响
• 1.2.5 愈伤组织的继代
• 1.2.6 胚性愈伤的选择与体胚的形成
• 1.3 讨论
• 1.3.1 仙客来胚性愈伤的诱导
• 1.3.2 仙客来胚性细胞的发生
• 1.4 小结
• 2. 悬浮体系的建立及体胚的发生
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 悬浮体系中细胞形态
• 2.2.2 培养体系的生长曲线
• 2.2.3 悬浮体系中体胚的发生
• 2.3 讨论
• 2.3.1 仙客来悬浮培养体系的最适细胞浓度
• 2.3.2 体胚发生的方式
• 2.3.3 2,4-D 在体细胞胚胎发生中的作用
• 2.4 小结
• 3. 仙客来体胚发生的组织学观察
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 仙客来胚性愈伤的组织学观察
• 3.2.2 仙客来体胚发生的观察
• 3.2.3 体胚的起源和发育
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 4. 仙客来体胚的发生及变异
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 固体培养基上体胚的发生及变异
• 4.2.2 悬浮体系中体胚的发生及变异
• 4.2.3 仙客来体胚的变异统计比较
• 4.2.4 仙客来体胚变异的组织学观察
• 4.3 讨论
• 4.3.1 影响仙客来体胚变异的因素
• 4.3.2 体胚变异的表现特征
• 4.4 小结
• 5. 仙客来体胚与合子胚发育途径的比较
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 仙客来合子胚形成的整体概述
• 5.2.2 仙客来体胚与合子胚发育过程的组织学比较
• 5.3 讨论
• 5.3.1 体胚与合子胚发育的不同和体胚变异
• 5.3.2 体胚与合子胚的发育途径
• 5.4 小结
• 6. 仙客来愈伤组织的超低温保存
• 6.1 材料和方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 方法
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 各因素对细胞存活率的相关性
• 6.2.2 预培养蔗糖浓度对冷冻后细胞活力的影响
• 6.2.3 预培养时间对冷冻后细胞活力的影响
• 6.2.4 不同冷冻方式对冷冻后细胞活力的影响
• 6.2.5 不同保护剂对冷冻后细胞活力的影响
• 6.3 讨论
• 6.4 小结
• 7. 植株再生
• 7.1 材料和方法
• 7.1.1 材料
• 7.1.2 方法
• 7.2 结果与分析
• 7.2.1 再生植株的形成
• 7.2.2 再生植株的变异
• 7.3 讨论
• 7.3.1 植株再生的影响因素
• 7.3.2 培养周期
• 7.3.3 体胚再生植株的变异及其应用
• 7.4 小结
• 第三章 仙客来体细胞胚胎发生的蛋白质组学
• 1. 仙客来体胚发生的蛋白质组学
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 实验方法
• 1.2 结果与分析
• 1.2.1 总蛋白的分离
• 1.2.2 体胚发生特异蛋白区分析
• 1.2.3 体胚发生相关蛋白分析
• 1.2.4 蛋白点的质谱鉴定
• 1.2.5 仙客来体胚发生相关蛋白的分类
• 1.3 讨论
• 1.3.1 仙客来体胚发生蛋白质组学研究的重要性
• 1.3.2 仙客来体胚发生的蛋白质组学分析
• 1.3.3 体胚发生相关蛋白的鉴定与功能分析
• 1.3.4 仙客来体胚发生研究的展望
• 2. 仙客来体胚变异的蛋白质组学研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 仙客来变异体胚的双向电泳图谱分析
• 2.2.2 差异点分析
• 2.3 讨论
• 第四章 结论
• 1. 仙客来体胚发生及植株再生
• 2. 仙客来体胚发生的蛋白质组学研究
• 3. 仙客来体胚变异的研究
• 参考文献
• 附录Ⅰ—图版
• 附录Ⅱ—图版说明
• 个人简介
• 导师简介
• 获得成果目录清单
• 致谢