Pseudomonas stutzeri LYS-86反硝化基因克隆及荧光标记

论文摘要

近几个世纪，由于工业的迅猛发展导致环境受到极其严重的污染，而氮素是水体中的主要污染物。目前应用最广泛的氮素污染控制方法之一是生物脱氮技术，即利用微生物完成硝化和反硝化作用，使氮素循环恢复正常。脱氮过程尤其是生物膜脱氮过程的研究一直是广受关注的领域，其中脱氮菌的荧光标记有利于对其在生物膜中作用机理的解析。本实验室已分离到一株具有好氧反硝化功能的菌株Pseudomonasstutzeri LYS-86，在有氧条件下，能够高效脱氮，且生长良好，具有潜在的工程应用价值。本文通过GenBank公布的编码硝酸盐还原酶，亚硝酸盐还原酶，一氧化氮还原酶以及一氧化二氮还原酶的基因序列，设计特异性引物，从Pseudomonas stutzeri LYS-86基因组中克隆得到了narG，nirS，norC和nosZ基因，从基因水平上佐证了菌株P. stutzeriLYS-86的反硝化功能，为其工业应用提供理论依据。脱氮菌Pseudomonas stutzeri LYS-86能吸附于海藻酸钙凝胶珠表面形成生物膜，为便于实时监测和考察该菌生物膜的形成与变化情况，需要构建荧光标记菌株。本文构建了含有Pseudomonas stutzeri LYS-86亚硝酸盐还原酶启动子Pnir的转座载体pUT/mini-Tn5-km2-Pnir-gfp，通过双亲本结合转座将mini-Tn5-km2-Pnir-gfp转座臂整合到P. stutzeri染色体中，得到重组菌P. stutzeri LYS-Pnir-gfp，荧光显微镜下观察发现重组菌P. stutzeri LYS-Pnir-gfp发出均匀的绿色荧光。在无选择压力下连续移植16次，重组菌P. stutzeri LYS-Pnir-gfp基因组中Pnir-gfp片段均未丢失，而且荧光发光稳定，荧光发光率保持在100%；重组菌P. stutzeri LYS-Pnir-gfp的脱氮功能也没有受到明显影响。荧光标记菌P. stutzeri LYS-Pnir-gfp可用于脱氮微生物生物膜的研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 生物膜
• 1.2.1 生物膜EPS 研究进展
• 1.2.2 生物膜中细菌标记技术比较
• 1.3.转座
• 1.3.1 转座现象简介
• 1.3.2 转座子种类及转座机制
• 1.3.3 转座作用的遗传效应
• 1.4 好氧同时硝化-反硝化菌的研究现状
• 1.5 研究背景及意义
• 1.6 研究内容及创新点
• 参考文献
• 第二章 Pseudomonas stutzeri LYS-86 反硝化基因的克隆
• 前言
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种和质粒: 本实验用到的菌株和质粒见表4-1。
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 生物化学试剂，酶及试剂盒
• 2.1.4 抗生素
• 2.1.5 PCR 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 基因组DNA 分离提取
• 2.2.2 试剂盒快速小量提取质粒DNA
• 2.2.3 凝胶回收纯化DNA
• 2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.5 转化大肠杆菌感受态细胞
• 2.2.6 连接反应
• 2.2.7 PCR 扩增
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 narG 基因部分基因片段的克隆
• 2.3.2 nir S 基因的克隆
• 2.3.3 nor C 基因的克隆
• 2.3.4 nos Z 基因的克隆
• 2.4 小结
• 参考文献
• 第三章 自杀性转座载体pUT/mini-Tn5-km2-Pnir-gfp的构建
• 前言
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌种与质粒
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 实验试剂
• 3.1.4 实验仪器
• 3.1.5 引物
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 引物设计与合成
• 3.2.2 基因组DNA 分离提取
• 3.2.3 试剂盒快速小量提取质粒DNA
• 3.2.4 凝胶回收纯化DNA
• 3.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 3.2.6 转化大肠杆菌感受态细胞
• 3.2.7 酶切反应
• 3.2.8 去磷酸化处理
• 3.2.9 连接反应
• 3.2.10 PCR 扩增
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 自杀性转座载体pUT/mini-Tn5-km2-Pnir-gfp 的构建流程
• 3.3.2 亚硝酸盐还原酶nir 启动子Pnir 的获得
• 3.3.3 重组质粒pEGFP-Pnir 的获得
• 3.3.4 pUT/mini-Tn5-km2-Pnir-gfp 的获得
• 3.4 小结
• 参考文献
• 第四章 荧光标记菌P. stutzeri LYS-Pnir-gfp性能研究
• 前言
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌种和质粒
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 实验试剂与器材
• 4.1.4 主要试剂
• 4.1.5 主要仪器设备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 荧光标记菌P. stutzeri LYS-Pnir-gfp 的获得
• 4.2.2 P. stutzeri LYS-Pnir-gfp 性能研究
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 P. stutzeri LYS-Pnir-gfp 的获得
• 4.3.2 P. stutzeri LYS-Pnir-gfp 基因组PCR 扩增鉴定
• 4.3.3 P. stutzeri LYS-Pnir-gfp 的荧光稳定性研究
• 4.3.4 P. stutzeri LYS-Pnir-gfp 的功能研究
• 4.4 小结
• 参考文献
• 第五章 研究总结与展望
• 致谢
• 研究生阶段发表论文情况