论文摘要
研究背景心血管疾病（Cardiovascular disease ,CVD）是慢性肾功能衰竭（Chronic renal failure,CRF）病人,尤其是终末期肾病病人（End-stage renal disease ,ESRD）最常见的并发症和最主要的死亡原因。透析治疗技术的长足进步虽然显著地减少了威胁终末期肾病患者急性事件的发生,但CRF病人并发心血管疾病而导致的死亡仍居高不下。长期透析病人死亡原因中,有50%系心血管事件所引起,是普通人群CVD导致死亡的1020倍,说明CVD是威胁依赖性透析病人长期生存的主要因素。虽然血脂和血糖代谢紊乱、高血压等CVD危险因素在透析病人的发生率明显高于普通人群,但仍然不能满意解释CRF病人CVD如此高的发病率和死亡率,提示尿毒症毒素可能是其促发因素之一。研究表明,已有多种尿毒症毒素与CVD有关,特别是新发现的尿毒症毒素AOPP已证明与动脉粥样硬化有明确关系,但其机制尚在研究中。进一步明确其机制,对防治这一常见并发症具有极大的临床意义。晚期氧化蛋白产物（Advanced oxidation protein products,AOPP）是Witko-Sarsat等于1996年首先报道的由尿毒症血液透析患者血浆中分离出的含有双酪氨酸的蛋白交联产物,系因患者体内过高的氧化应激水平导致各种蛋白质氧化损伤所形成的终末产物的总称。AOPP随着慢性肾功能衰竭及氧化应激的进展,在患者的循环和组织中潴留,是一类新的尿毒症毒素。AS患者血浆AOPP水平明显高于正常人。血液透析的CRF病人颈动脉内膜厚度与血浆AOPP水平呈正相关。静脉反复注射AOPP可加速饲喂高胆固醇饲料兔AS斑块的形成。上述研究提示,AOPP可能参与了AS的形成,但其机制目前还不清楚。单核细胞黏附于血管壁并穿入内皮下形成泡沫细胞是动脉粥样硬化的早期病变,而平滑肌细胞增生、迁移形成平滑肌肌源性泡沫细胞是该病较晚期病变。大量研究表明单核细胞的趋化主要由单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1）MCP-1来实现,多种物质及细胞因子都可以诱导MCP-1的表达,而MCP-1也可在多种细胞尤其是构成动脉粥样硬化病变的三种主要细胞-单核细胞、内皮细胞和平滑肌细胞中表达。有报道,AOPP通过氧化应激引起内皮细胞损伤可能是其参与AS发生、发展的机制之一。然而,AOPP对血管平滑肌细胞的影响尚无报道。本研究采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫印迹法（Western blotting）检测探讨AOPP是否通过对血管平滑肌细胞单核细胞趋化蛋白-1表达的影响而参与了动脉粥样硬化的晚期病变的可能机制。细胞外信号向细胞核转导信息时,需要细胞内信号分子的参与。丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）级联系统是细胞内主要的信号转导系统,细胞运用这一系统将细胞外刺激信号传递到细胞核,介导细胞产生反应。哺乳动物细胞MAPK通路主要有:ERK,JNK/SAPK, p38三条途径及目前所知相对较少的ERK5等通路。有研究提示,p38信号通路很可能是各种致AS病变因素的共同通路。本研究也对p38-MAPK信号传导通路在AOPP诱导MCP-1表达过程中的地位和作用了进行研究,为阻断这一途径寻找理论依据。并在临床观察不同透析模式对清除AOPP的影响及大剂量维生素C预冲透析器对尿毒症患者AOPP的影响,为探索临床防治CRF并发症寻找新方法。结果1、AOPP以时间和剂量依赖的方式刺激血管平滑肌细胞合成分泌MCP-1增多。Western blotting检测结果显示,AOPP刺激的鼠血管平滑肌细胞MCP-1的表达呈浓度依赖性;400μmol/L AOPP刺激的MCP-1与阳性对照者的MCP-1在相同时间表达水平一致。AOPP-HSA 400μmol/L不能使VSMCs对MCP-1的表达进一步升高。MCP-1蛋白质浓度从干预后一直呈升高趋势,24h仍维持较高水平,与12h组相比,差异无显著性意义（说明12小时已经达高峰）。2、AOPP以时间和剂量依赖的方式刺激血管平滑肌细胞高表达MCP-1 mRNA。MCP-1mRNA在未被干预的VSMCs中有表达,随AOPP-HSA浓度逐步升高.MCP-1的表达水平也逐步升高,mRNA表达高峰在200μmol/L。干预1h时, MCP-1mRNA的表达较基础状态明显上升,4h达高峰,在24h时完全停止。3、为了证明AOPP作用的特异性,我们在Western blot和RT-PCR实验中观察了两种不同的AOPP （AOPP-HSA, AOPP-BSA）和两种非AOPP修饰的蛋白质（HSA, BSA）对MCP-1合成的影响,发现未经AOPP修饰的HSA或BSA对平滑肌细胞合成MCP-1无刺激作用,且AOPP-HSA和AOPP-BSA作用之间无明显差异,说明AOPP特异刺激平滑肌细胞合成释放MCP-1,而不是蛋白质本身的作用;为了排除可能存在的内毒素对试验的影响,我们观察了内毒素鳌合剂多粘菌素B（PMX-B）对AOPP刺激平滑肌细胞合成MCP-1作用的影响。结果显示,加入PMXB后,AOPP对MCP-1合成的刺激作用没有消失或减弱,说明实验结果没有受到内毒素的干扰。4、在刺激平滑肌细胞生成MCP-1的同时,AOPP以时间和剂量依赖的方式活化p38-MAPK信号途径。p38通路的特异阻断剂SB203580能够阻断AOPP对平滑肌细胞合成释放MCP-1的促进作用,说明AOPP对平滑肌细胞合成MCP-1的刺激作用是经由p38-MAPK途径介导的。5、尿毒症病人（未行血液透析）的AOPP较正常对照组显著升高,而经过半年血液透析的病人其AOPP较未透析病人又明显升高,但透析前经过大剂量维生素C预处理透析器后其AOPP明显下降。差异有统计学意义。单次HD治疗,其AOPP略有下降,半年后,AOPP水平明显升高, HDF治疗组则明显下降;单次HP治疗后,AOPP水平明显下降,但半年后差异无显著性意义。结论1、AOPP通过促进鼠平滑肌细胞MCP-1mRNA和蛋白表达参与了尿毒症患者加速性动脉粥样硬化的病变过程。2、由于AOPP诱导的鼠血管平滑肌细胞MCP-1的表达经P38MAPK信号转导途径介导。所以P38信号通路阻断剂可能是防治尿毒症患者心血管并发症的一种新途径。3、临床观察显示长期HDF治疗和大剂量Vc预冲透析器也可能是减少尿毒症患者心血管并发症的一种手段。
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