论文摘要
研究背景毛囊是一种结构复杂的皮肤附属器官,由属于上皮成分的内毛根鞘、外毛根鞘、毛母质和属于真皮成分的真皮鞘、毛乳头组成。毛囊最为显著的特点是始终处于生长期、退行期和休止期的周期性循环中,许多激素、细胞因子、生长因子及其受体等相互作用,形成网络,共同调控着毛囊的周期性循环和毛发生长。研究证实,毛囊周围的血管形成具有毛发循环依赖性的特征,表现为生长期毛囊周围的血管密度和体积最大,到退行期和休止期逐渐减小。而且,毛囊周围的血管体积增加后,毛球的最大直径和毛干的直径也相应增加;相反,抑制毛囊周围的血管形成后,毛囊延迟进入生长期。因此,毛囊周围的血管形成在调节毛囊的周期性循环和毛发生长中起着十分重要的作用。毛囊周围的血管形成是一个非常复杂的过程,涉及众多的血管生成因子、血管活性因子和抑制性因子等。血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）又称血管渗透因子（vascular permeability factor,VPF）或血管调理素（vasculotropin）,是近年来发现的一种毛囊起源的血管生成因子,生长期毛囊的毛乳头细胞、真皮鞘细胞和外毛根鞘细胞均可以合成与分泌VEGF,而退行期和休止期毛囊中VEGF的表达明显减少或消失。目前认为,VEGF促进毛发生长的可能机制有:①促进毛乳头细胞的增殖和迁移;②诱导毛囊周围的血管形成;③通过增加血管内皮细胞的通透性而促进营养物质的跨内皮转运,增加毛囊的营养供应;④刺激蛋白酶的合成,利于毛囊的重新塑形。据此,VEGF作为一种血管生成因子,其促进毛发生长的机理并不仅仅局限于诱导毛囊周围的血管形成。血管生成素（angiogenin）是由123个氨基酸组成、分子量为14 kDa的分泌性蛋白,属于胰腺核糖核酸酶超家族。1985年由Fett等首次从培养的人结肠癌细胞株HT-29的无血清上清中分离得到,具有很强的促进血管生成的能力。已经发现,血管生成素在许多肿瘤如前列腺癌、恶性黑素瘤和肝癌中表达明显上调,而且其表达水平与肿瘤的侵袭性和血管形成显著相关。另外,正常人血清、卵泡液、睾丸和子宫内膜中也表达血管生成素。因此,血管生成素的广泛分布提示其不仅参与血管形成,而且可能具有多种生物学功能。然而,到目前为止,血管生成素是否在人毛囊中表达及其对毛发生长的可能作用国内外尚未见报道。目的探讨血管生成素在人毛囊不同部位中的表达,并进一步研究血管生成素促进毛发生长的作用及其可能的机制。方法第一部分:人毛囊分离及人毛乳头细胞和外毛根鞘细胞培养利用解剖法在显微镜下分离完整的人毛囊,两步酶法分离培养人毛乳头细胞和外毛根鞘细胞。第二部分:血管生成素在人毛囊中的表达RT-PCR检测血管生成素mRNA在人毛囊中的表达,免疫荧光检测血管生成素蛋白在人毛囊不同部位中的表达。同时,ELISA检测血管生成素在体外培养的人毛囊上清中的表达,结合人毛囊的生长曲线,比较培养不同时间血管生成素的表达与毛囊生长长度之间的关系。第三部分:血管生成素在人毛乳头细胞中的表达RT-PCR检测血管生成素mRNA在人毛乳头细胞中的表达,western blot和免疫荧光检测血管生成素蛋白在人毛乳头细胞中的表达,ELISA检测血管生成素蛋白在人毛乳头细胞上清中的表达。第四部分:血管生成素在小鼠皮肤不同毛发周期中的表达利用松香/石蜡拔毛法拔除C57BL/6小鼠背部毛发,诱导毛囊同步进入生长期,分别在拔毛后第0、1、3、5、8、12、17、19、20、25天颈椎脱臼法处死小鼠,背部相同部位平行于脊椎取皮肤组织,TRIZOL提取总RNA,半定量RT-PCR检测血管生成素mRNA在小鼠皮肤不同毛发周期中的表达。第五部分:血管生成素局部注射对小鼠皮肤血管形成和毛发周期的影响利用松香/石蜡拔毛法拔除C57BL/6小鼠背部毛发,诱导毛囊同步进入生长期,拔毛后第0天在小鼠背部皮内注射100μL 10ng/μL重组人血管生成素（1μg）,连续7天,对照组注射100μL 0.1%BSA-PBS。第10天观察注射部位皮肤的颜色和血管形成,同时取皮肤组织HE染色后,测量皮肤厚度和生长期Ⅵ毛囊比例。第六部分:血管生成素对体外培养的人毛囊生长的影响在体外培养的人毛囊中,加入不同浓度的重组人血管生成素（0-200ng/mL）,同时加或不加抗人血管生成素的中和性抗体,培养6天,测量毛囊的生长长度。第七部分:血管生成素对体外培养的人毛乳头细胞增殖的影响在体外培养的人毛乳头细胞中,加入不同浓度的重组人血管生成素（0-200ng/mL）,加或不加抗人血管生成素的中和性抗体,48h后,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期。同时,将血管生成素的真核表达载体pEGFP-ANG转染人毛乳头细胞,设立转染pEGFP-C2组和单纯转染液组作为对照,转染后培养48h,MTT法检测细胞增殖。第八部分:血管生成素对体外培养的人外毛根鞘细胞增殖的影响在体外培养的人外毛根鞘细胞中,加入不同浓度的重组人血管生成素（0-200ng/mL）,加或不加抗人血管生成素的中和性抗体,48h后,MTT法检测细胞增殖。结果第一部分:人毛囊分离及人毛乳头细胞和外毛根鞘细胞培养成功分离并培养了原代的人毛乳头细胞和外毛根鞘细胞。第二部分:血管生成素在人毛囊中的表达RT-PCR检测发现人毛囊表达血管生成素mRNA,PCR产物大形?52bp,经基因测序,与Gene Bank公布的序列完全一致。免疫荧光显示人毛囊的毛乳头和真皮鞘表达血管生成素蛋白,而外毛根鞘、内毛根鞘和毛母质不表达血管生成素蛋白,提示血管生成素表达在毛囊的真皮部位。ELISA检测结果显示体外培养的人毛囊上清中表达血管生成素蛋白,在培养的第2个48h内（第2-4天）血管生成素的表达和毛囊的生长长度均达到高峰,说明血管生成素的表达与毛囊的生长速度之间可能存在一定的相关性。第三部分:血管生成素在人毛乳头细胞中的表达RT-PCR检测发现培养的人毛乳头细胞表达血管生成素mRNA,PCR产物大小为352bp,经基因测序,与Gene Bank公布的序列完全一致。Western blot显示人毛乳头细胞表达14 kDa的血管生成素蛋白。免疫荧光进一步证实血管生成素蛋白表达在人毛乳头细胞的细胞浆内,而不表达在细胞核内。毛乳头细胞培养48h后,ELISA检测发现培养上清中血管生成素蛋白的含量为85.499±3.153 pg/105细胞。第四部分:血管生成素在小鼠皮肤不同毛发周期中的表达利用松香/石蜡拔毛法拔除C57BL/6小鼠背部毛发,可成功诱导毛囊同步进入生长期,拔毛后小鼠背部皮肤颜色逐渐由粉红色变为灰色、黑色,最后又由黑色变为灰色和粉红色。半定量RT-PCR发现小鼠皮肤中表达血管生成素mRNA,PCR产物大小为265bp,经基因测序,其序列与Gene Bank公布的完全一致。通过与内参GAPDH对比,拔毛后小鼠皮肤组织中血管生成素mRNA的表达具有毛发循环依赖性的特征,表现为生长期早期逐渐增加,生长期中晚期迅速增加,到生长期Ⅵ（拔毛后12天）达到高峰,以后在退行期早期迅速下降,到退行期晚期又逐步恢复到先前休止期时的水平。第五部分:血管生成素局部注射对小鼠皮肤血管形成和毛发周期的影响拔毛后连续7天局部皮内注射血管生成素（总计7μg）,到第10天时局部皮肤颜色为灰黑色,与对照组相比无明显差异。但在皮肤反面,可以清楚地观察到注射血管生成素的小鼠皮肤血管的分支明显增多,而且其并不局限在注射部位。组织学上,注射血管生成素的小鼠皮肤厚度和生长期Ⅵ毛囊的比例明显高于对照组（p＜0.05）。第六部分:血管生成素对体外培养的人毛囊生长的影响体外培养的人毛囊中加入不同浓度的重组人血管生成素,培养6天后,25-100ng/mL重组人血管生成素能够明显促进体外培养的人毛囊生长（p＜0.001）,并且具有一定的剂量依赖性。而低于25ng/mL的重组人血管生成素对人毛囊生长无明显影响（p＞0.05）。加入抗人血管生成素的中和性抗体,能够完全抑制重组人血管生成素促进毛囊生长的作用。第七部分:血管生成素对体外培养的人毛乳头细胞增殖的影响MTT检测发现低于12.5ng/mL重组人血管生成素对毛乳头细胞的增殖没有影响（p＞0.05）,而12.5-200ng/mL重组人血管生成素能够明显促进毛乳头细胞增殖（p＜0.001）,其中以50ng/mL和100ng/mL重组人血管生成素促进毛乳头细胞增殖的作用最为显著（p＜0.001）。而且,加入抗人血管生成素的中和性抗体能够完全阻断重组人血管生成素促进毛乳头细胞增殖的作用。人毛乳头细胞转染pEGFP-ANG后48h,MTT检测结果显示转染pEGFP-ANG组的毛乳头细胞增殖活性明显高于转染pEGFP-C2组和单纯转染液组（p＜0.001）,而转染pEGFP-C2组和单纯转染液组毛乳头细胞的增殖无明显差异（p＞0.05）。流式细胞仪检测显示,12.5-200ng/mL重组人血管生成素能够明显增加毛乳头细胞S期细胞比率和细胞增殖指数（proliferation index,PI）（p＜0.05）。S期细胞比率与血管生成素之间具有剂量依赖性关系,随着血管生成素浓度的增加,S期细胞比率逐渐增加,当血管生成素为200 ng/mL时S期细胞比率最大。与对照组相比,血管生成素作用后PI明显增加,以100ng/mL血管生成素作用最为显著（p＜0.05）。第八部分:血管生成素对体外培养的人外毛根鞘细胞增殖的影响体外培养的人外毛根鞘细胞加入不同浓度的重组人血管生成素,培养48h后,MTT检测结果发现3.13-200ng/mL重组人血管生成素能够明显促进外毛根鞘细胞增殖（p＜0.001）,且以12.5ng/mL作用最为显著（p＜0.001）。低于3.13ng/mL的重组人血管生成素对外毛根鞘细胞增殖无明显影响（p＞0.05）。同时加入抗人血管生成素的中和性抗体,可以完全阻断由血管生成素引起的外毛根鞘细胞增殖。结论1.血管生成素是一种新的毛囊起源的血管生成因子,表达在人毛囊的毛乳头和真皮鞘,且毛囊上清中血管生成素的表达量与毛囊的生长速度呈正相关。2.体外培养的人毛乳头细胞也能够合成与分泌血管生成素,血管生成素表达在人毛乳头细胞的细胞浆内。3.血管生成素mRNA在小鼠皮肤中的表达具有毛发循环依赖性的特征,生长期晚期表达最高,到退行期和休止期逐渐减少。4.血管生成素具有促进毛发生长和调节毛囊周期性循环的作用,其作用机制可能为:（1）.诱导局部皮肤的血管形成;（2）.诱导毛囊进入生长期;（3）.促进毛乳头细胞的增殖;（4）.促进外毛根鞘细胞的增殖。