抗鹅α干扰素单克隆抗体的制备及初步鉴定

论文摘要

自从1957年英国科学家Isaacs和Lindenmann发现干扰素（Interferon,IFN）以来,干扰素的分子结构、基因结构和分子生物学特性一直被人们所关注。干扰素是一种低分子量的可溶性糖蛋白,具有抗病毒和抗肿瘤的作用。干扰素分为Ⅰ型干扰素和Ⅱ型干扰素,前者包括IFN-α和IFN-β等,IFN-α具有很强的抗病毒能力。IFN-α主要由白细胞、Namalwa细胞、KG-1细胞、B淋巴细胞、慢性髓性白血病细胞、鸡新城疫病毒（NDV）或水泡性口炎病毒（VSV）等诱导后的成纤维细胞产生。用本实验室已构建的含鹅α干扰素基因的真核表达载体pcDNA3.1-IFN-α作为免疫原,免疫Balb/C鼠,以原核表达的重组GoIFN-α作为检测抗原,检测抗鹅α干扰素的单克隆抗体。经过细胞融合,以间接ELISA方法和有限稀释法进行筛选,经35次亚克隆,获得2株能稳定分泌抗鹅α干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2H6和4C8。经鉴定,2株杂交瘤细胞染色体数目分别为103和89条;单抗亚类均为IgM,轻链为κ链;杂交瘤细胞株连续传20代以上及冻存后复苏,细胞生长良好,效价稳定;腹水效价均达到10-4以上;Western blot表明,McAb 2H6及4C8与重组鹅IFN-α均能发生特异性反应;竞争ELISA检测结果显示,McAb 4C8能与天然干扰素发生竞争抑制作用,为进一步进行干扰素的检测奠定了基础。由于2株单抗与天然及重组干扰素发生的特异性反应有所区别,估计2株细胞抗体可能分别针对不同的抗原表位;单抗中和活性检测结果显示,McAb 4C8能够中和天然干扰素的抗病毒作用。总之,McAb 2H6及4C8的制备为进一步研究和检测鹅IFN-α提供了有利的前提条件,并为鹅α干扰素在免疫机制研究、免疫功能检测、纯化鹅IFN-α等领域提供了广泛的应用前景。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 干扰素的分类及来源
• 1.2 干扰素的产生特点
• 1.3 干扰素α分子生物学特性
• 1.3.1 干扰素α的结构特征
• 1.3.2 干扰素 α 受体
• 1.3.3 干扰素 α 生物学特性
• 1.4 IFN 的信号传导
• 1.5 干扰素的生物学功能
• 1.5.1 抗病毒作用
• 1.5.2 抗肿瘤作用
• 1.5.3 免疫调节作用
• 1.6 禽类干扰素的研究进展
• 1.6.1 禽类Ⅰ型干扰素的研究进展
• 1.6.2 禽类 II 型干扰素的研究进展
• 1.7 本课题研究的目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种及病毒株
• 2.1.2 实验动物、细胞
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 仪器
• 2.1.5 主要溶液配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 重组质粒的大量提取及纯化
• 2.2.2 重组蛋白的表达及浓度测定
• 2.2.3 间接ELISA 检测方法的建立
• 2.2.4 单克隆抗体的制备
• 2.2.5 单克隆抗体的初步鉴定
• 2.2.6 杂交瘤细胞的鉴定
• 2.2.7 单克隆抗体与天然干扰素的反应性
• 2.2.8 McAb 中和能力测定
• 3 结果与分析
• 3.1 重组质粒酶切鉴定
• 3.2 重组干扰素α的表达
• 3.3 ELISA 筛选方法的建立
• 3.3.1 最佳抗原及抗体工作浓度的确定
• 3.3.2 待检血清作用时间的确定
• 3.3.3 二抗作用时间的确定
• 3.3.4 底物显色液作用时间的确定
• 3.4 杂交瘤细胞的融合率
• 3.5 获得的杂交瘤细胞株
• 3.6 单克隆抗体鉴定
• 3.6.1 单克隆抗体Ig 亚类鉴定
• 3.6.2 单克隆抗体交叉反应识别特异性鉴定
• 3.6.3 单克隆抗体腹水效价测定
• 3.7 杂交瘤细胞株的鉴定
• 3.7.1 杂交瘤细胞的染色体数目分析
• 3.7.2 杂交瘤细胞稳定性测定
• 3.8 单克隆抗体与天然干扰素的反应性
• 3.9 McAb 中和实验
• 4 讨论
• 4.1 免疫方式的选择
• 4.2 关于抗IFN-α单克隆抗体的特性
• 4.3 应用单抗检测天然干扰素的探索
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文