禽白血病病毒逆转录环介导等温扩增检测方法的研究

论文摘要

环介导等温核酸扩增技术依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的4条引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶,在等温条件下（63℃65℃）可高效、快速、高特异地扩增靶序列。本研究针对ALV的gag基因设计引物,筛选禽白血病病毒逆转录环介导等温扩增方法特异性引物、优化禽白血病病毒逆转录环介导等温扩增方法的条件,建立禽白血病病毒逆转录环介导等温扩增快速检测方法（ALV RT-LAMP）,并研究RT-LAMP方法用于临床检测ALV的可行性,为ALV的快速诊断、病原监测及分子流行病学调查提供有力工具。本研究针对ALV gag基因保守区设计合成的4套ALV RT-LAMP特异性引物,对鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）、禽网状内皮细胞增生征病毒（REV）、鸡新城疫病毒（NDV）、鸡传染性支气管炎病毒（IBV）、鸡产蛋下降综合征病毒（EDSV）、禽流感病毒（AIV）等病原核酸扩增结果均为阴性。以其中一套特异性引物为反应引物,ALV RAV-1毒株为试验模板对ALV RT-LAMP反应体系的Betaine、Mg2+、dNTP、Bst DNA大片段聚合酶、AMV反转录酶、引物等反应试剂的用量及温度、时间等反应条件进行了优化,确定了最佳反应体系。ALV RT-LAMP扩增结果通过直接观察扩增产物的浊度、凝胶电泳观察斑马样条带的生成、荧光检测法及实时浑浊仪检测LAMP反应四种方式进行判定,尤以LAMP方法特征性结果判定方式直接观察扩增产物浊度最为简单便捷。初步建立了ALV RT-LAMP方法。ALV RT-LAMP敏感性试验结果显示,RT-LAMP方法能够检测0.2TCID50/0.1mL禽白血病病毒或1pg病毒核酸,且与ELISA方法、PCR方法比较,RT-LAMP方法敏感性更高。ALV RT-LAMP特异性试验的酶切鉴定和测序结果均与理论结果相符,表明RT-LAMP方法可以特异性扩增ALV。且60分钟内便可完成扩增反应。本研究成功建立了ALV RT-LAMP方法。将建立的ALV RT-LAMP方法对60批禽用活疫苗进行了禽白血病病毒污染检验,结果RT-LAMP方法检测出11批阳性样品（18.3%）。用标准规定的ELISA方法检测出10批阳性（16.67%）。RT-LAMP方法与ELISA方法的阳性符合率为91%。RT-LAMP方法是一种简单快速灵敏的检测ALV的方法。ALV RT-LAMP方法的建立为禽用活疫苗中污染ALV的检测提供了新的参考方法,也为兽医临床样品的ALV检测提供新的检测方法。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACTS
• 缩略词表
• 第一章 引言
• 1.1 禽白血病概述
• 1.2 禽白血病病毒的检测方法研究进展
• 1.3 环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）概述
• 1.4 研究目的和意义
• 第二章 禽白血病病毒环介导等温扩增检测方法的研究
• 2.1 材料和仪器
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 ALV RT-LAMP在禽用活疫苗检测中的应用
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历