甜菊苷的定向转化及产物甜茶苷的分离纯化

论文摘要

甜菊糖是从甜叶菊（Stevia rebaudiana bertoni）中提取的一种天然甜味剂,主要成分为甜菊苷（SS）和莱鲍迪甙A（RA）。甜茶苷（RS）是从高山植物甜茶中提取出来的天然甜味剂,产量低且受地域条件的限制,如果能用生物转化的方法将SS转化为RS,可为RS的生产提供全新的方法,减少因种植甜茶而带来的山地生态破坏。本工作筛选了一株能特异性转化甜菊苷为甜茶苷的细菌。结合菌体、菌落的形态特征及16S rDNA序列鉴定,确定其为黄杆菌（Chryseobacterium sp.,专利保藏号为CCTCC NO:M209202）。该菌能专一性对SS进行转化,而不作用于甜菊糖中的其他成分。经单因素试验,优化了该菌的培养条件,结果表明,木薯淀粉1%,蛋白胨1%,K2HPO4 0.5%, KH2PO4 0.5%, NaCl 0.2%,硫酸镁0.04%是适宜的培养基成分,在pH7.0,37℃,50 mL/250 mL,接种量10%的条件下,48h可将10 mg/mL甜菊糖溶液中的甜菊苷（7.2 mg/mL）完全转化。该菌所产酶为胞内酶,采用高压破壁,在45℃,pH值7.0,底物浓度10 mg/mL的条件下,12h甜菊苷的转化率为95%,15 h可完全转化。用不同的表面活性剂对细胞进行破壁,当SDS添加量0.2%,12h转化率为90%,CTAB添加量1%时,12h转化率为74%,Triton-100添加2%,12h转化率达到100%。以海藻酸钠为包埋材料,对黄杆菌胞内酶进行固定化,在海藻酸钠浓度4%,氯化钙浓度2%,经2h的固定化,然后在45℃,pH7.0,在10 mLl%甜菊糖溶液中添加15g固定化酶,固定化酶可重复利用3次,转化效率保持在80%以上。用大孔树脂对RS进行分离纯化,研究表明,1体积的CN-308树脂可以完全吸附10倍体积转化液中的糖分。上样液为27.5BV时,RS与RA吸附饱和。用70%乙醇作为洗脱剂,洗脱液体积为1.5BV时,RS纯度为96%.

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1.1 甜菊苷概况
• 1.2 甜茶苷的研究概况
• 1.2.1 研究概述
• 1.2.2 甜茶苷的提取、分离纯化及检测
• 1.2.3 甜茶苷的功用
• 1.3 本文研究目的、意义及内容
• 第二章 甜菊苷转化微生物的筛选与鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料与试剂
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.3 仪器与设备
• 2.2 甜菊苷转化微生物的筛选与鉴定
• 2.2.1 转化微生物的筛选
• 2.2.2 JH菌的鉴定
• 2.3 JH菌对甜菊苷的转化及产物鉴定
• 2.3.1 JH菌对甜菊苷的转化
• 2.3.2 转化产物的鉴定
• 2.4 本章小结
• 第三章 JH菌对甜菊苷的转化研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料与试剂
• 3.1.2 仪器与设备
• 3.2 培养基的优化
• 3.2.1 碳源对转化效果的影响
• 3.2.2 氮源对SS转化的影响
• 3.2.3 无机盐对SS转化的影响
• 3.2.4 活化培养基中SS添加量对SS转化的影响
• 3.3 菌液对SS转化条件探讨
• 3.3.1 不同的装液量对转化效果的影响
• 3.3.2 接种量对转化效果的影响
• 3.3.3 温度对转化效果的影响
• 3.3.4 起始pH值对转化效果的影响
• 3.3.5 底物浓度对SS转化的影响
• 3.3.6 最优条件下转化时间曲线
• 3.4 本章小结
• 第四章 胞内酶对甜菊苷的转化研究
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 菌种与材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.1.3 仪器和设备
• 4.2 转化SS酶的探讨
• 4.2.1 细胞,胞内、外液对SS的转化
• 4.2.2 培养基对胞内酶活性的影响
• 4.3 胞内酶转化特性研究
• 4.3.1 温度对转化效果的影响
• 4.3.2 pH对转化效果的影响
• 4.3.3 酶液量对转化效果的影响
• 4.3.4 底物浓度对转化效果的影响
• 4.3.5 最适条件下胞内酶转化效果的时间曲线
• 4.4 抗生素添加量的研究
• 4.5 细胞破壁的方法研究
• 4.5.1 胆酸钠破壁后对胞内酶转化效果的影响
• 4.5.2 SDS破壁后对胞内酶转化效果的影响
• 4.5.3 CTAB破壁后对胞内酶转化效果的影响
• 4.6 本章小结
• 第五章 固定化酶对甜菊苷的转化研究
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 菌种与材料
• 5.1.2 实验方法
• 5.1.3 仪器和设备
• 5.2 海藻酸钠固定化酶制备条件优化
• 5.2.1 海藻酸钠浓度对酶转化效果的影响
• 5.2.2 不同酶液量与海藻酸钠溶液量之比对转化效果影响
• 5.2.3 氯化钙浓度对固定化酶转化效果的影响
• 5.2.4 固定化时间对固定化酶转化效果的影响
• 5.3 固定化酶转化条件探讨
• 5.3.1 温度对固定化酶转化效果的影响
• 5.3.2 pH对固定化酶转化效果的影响
• 5.3.3 固定化酶添加量对转化效果的影响
• 5.3.4 底物浓度对转化效果的影响
• 5.3.5 固定化酶的重复使用
• 5.4 本章小结
• 第六章 大孔树脂对甜菊糖转化产物甜茶苷的分离纯化
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料与试剂
• 6.1.2 实验方法
• 6.1.3 仪器与设备
• 6.2 树脂的筛选
• 6.2.1 树脂的静态吸附
• 6.2.2 树脂的静态洗脱
• 6.3 树脂的分离纯化研究
• 6.3.1 树脂的动态吸附
• 6.3.2 树脂的动态洗脱
• 6.4 结论
• 第七章 结论与展望
• 7.1 结论
• 7.2 展望
• 附录
• 1 甜菊苷（SS）含量HPLC测定标准曲线
• 2 莱鲍迪甙A（RA）含量HPLC测定标准曲线
• 参考文献
• 论文及专利
• 致谢