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扇贝大防御素和G型溶菌酶的基因克隆与重组表达

2020-11-22阅读(470)

扇贝大防御素和G型溶菌酶的基因克隆与重组表达

论文摘要

扇贝养殖是我国传统的海水养殖产业,但自1997年以来,养殖扇贝陆续爆发的大规模死亡,不但造成了巨大的经济损失,而且严重影响了该产业的健康发展。扇贝病害的不断爆发以及病因的多样性迫切要求制定新的疾病防治措施和开发新型的抗菌物质。从扇贝自身的免疫防御因子入手,筛选和克隆参与免疫防御的功能基因,一方面可以研究抗病功能基因在病原感染或环境胁迫条件下的表达规律,深入探讨扇贝的免疫防御机制,并可作为抗病良种选育的分子标记,指导扇贝的遗传改良和抗病品系的培育;另一方面,可对抗菌效应物实现重组表达,开发新型的病害预防治疗制剂,取代目前普遍使用的抗生素和化学药物。抗菌效应物是机体在免疫应答过程中产生的多肽类物质,对侵入生物体内的细菌、病毒具有很强的免疫杀灭作用,对抗菌效应物的研究有助于深入了解机体先天性免疫防御的机制。本研究采用大规模EST测序方法,结合cDNA末端快速扩增（RACE）技术,从海湾扇贝血淋巴中克隆到了大防御素基因（big defensin, AiBD）的全长cDNA序列,该cDNA全长为531 bp,其中5’非编码区（UTR）为24 bp,开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）含有369 bp,编码122个氨基酸残基;随后为138-bp的3’ UTR,包括一个多聚腺苷酸信号序列（AATAAA）和ploy A尾巴。分析表明,海湾扇贝大防御素是以前体的形式合成,前体分子包括信号肽、前域和成熟肽三部分。采用Northern blot方法,以DIG标记的DNA探针检测了AiBD mRNA在不同组织中的表达。结果发现,AiBD基因的转录本主要在血淋巴中表达,在鳃中也有微量的表达,而在外套膜、闭壳肌、性腺及肝胰腺中检测不到杂交信号。采用QRT-PCR（quantitative real time PCR）对鳗弧菌感染后海湾扇贝血淋巴中AiBD mRNA的表达量进行了检测,结果发现在感染后8 h内, AiBD mRNA的相对表达量平缓升高;随着刺激时间的增长,AiBD基因的mRNA表达量急剧增加,在刺激后16 h和32 h分别达到了空白组的72.3倍和131.1倍。为了研究海湾扇贝大防御素的抗菌活性,将其成熟肽编码区克隆到毕赤酵母表达载体

论文目录

  • 中文摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 文献综述
  • 一、无脊椎动物的先天性免疫
  • 1. 非己的识别
  • 1.1. 病原相关分子模式
  • 1.2. 模式识别受体
  • 1.2.1. 肽聚糖识别蛋白
  • 1.2.2. 硫酯蛋白
  • 1.2.3. 革兰氏阴性菌结合蛋白
  • 1.2.4. 清道夫受体
  • 1.2.5. C型凝集素
  • 1.2.6. 硫依赖型凝集素
  • 1.2.7. Toll 样受体
  • 2. 免疫信号的调整和放大
  • 2.1. 丝氨酸蛋白酶级联反应
  • 2.1.1. 血淋巴凝集系统
  • 2.1.2. 前酚氧化酶激活系统
  • 2.2. 免疫信号传导途径
  • 2.2.1. Toll 信号传导通路
  • 2.2.2. Imd 信号通路
  • 3. 病原体的清除
  • 3.1. 细胞免疫
  • 3.2. 体液免疫
  • 二、我国贝类养殖现状及贝类免疫学研究进展
  • 1. 贝类养殖业面临的问题及养殖业可持续发展的策略
  • 2. 软体动物免疫防御机制
  • 2.1. 贝类血淋巴细胞形态结构
  • 2.2. 贝类血细胞的吞噬作用
  • 2.3. 贝类血细胞的包裹作用
  • 2.4. 贝类天然免疫的体液因子
  • 三、本研究的目的和意义
  • 1. 本研究的目的
  • 2. 本研究的意义
  • 第二章 材料与方法
  • 一、材料
  • 1. 应激实验样品及样品处理
  • 2. Northern 杂交样品的处理
  • 3. 主要化学试剂及仪器设备
  • 二、方法
  • 1. 扇贝总RNA 的提取
  • 2. CDNA 文库的构建与序列分析
  • 3. 基因组DNA 的提取方法
  • 4. 基因组Walking 文库的构建
  • 5. RACE 扩增获得全长CDNA 序列
  • 6. 琼脂糖凝胶回收PCR 产物
  • 7. 质粒的制备
  • 8. 感受态细胞的制备、连接和转化
  • 9. 目的基因的生物信息学分析
  • 10. Northern 杂交
  • 11. QRT-PCR 检测目的基因的表达
  • 12. 毕赤酵母的重组表达
  • 第三章 海湾扇贝大防御素基因的克隆表达及其重组产物的抗菌活性研究
  • 一、研究背景
  • 二、材料与方法
  • 1. 海湾扇贝大防御素基因3' 末端的克隆
  • 2. 海湾扇贝大防御素基因5' 末端的克隆
  • 3. 序列注册
  • 4. Northern 杂交
  • 5. 实时定量PCR 分析海湾扇贝大防御素基因的时序表达
  • 6. 重组质粒的构建
  • 7. 重组表达载体转化及表达产物检测
  • 8. 琼脂扩散法检测重组产物的抗菌活性
  • 三、结果
  • 1. 海湾扇贝大防御素基因AiBD 的克隆
  • 2. 海湾扇贝大防御素基因AiBD 的核苷酸序列分析
  • 3. 海湾扇贝大防御素的同源性分析
  • 4. 海湾扇贝大防御素的结构预测
  • 5. 海湾扇贝大防御素基因AiBD 的组织分布
  • 6. 实时定量PCR 检测鳗弧菌刺激下AiBD 基因的表达
  • 7. 海湾扇贝大防御素的重组表达和活性分析
  • 四、讨论
  • 第四章 栉孔扇贝G 型溶菌酶的基因克隆及重组产物的抗菌活性研究
  • 一、研究背景
  • 二、材料与方法
  • 1. 栉孔扇贝G 型溶菌酶基因全长cDNA 的克隆
  • 2. 栉孔扇贝G 型溶菌酶基因序列的克隆
  • 3. 序列注册
  • 4. Northern 杂交
  • 5. 序列比较与系统进化分析
  • 6. 重组质粒的构建
  • 7. 重组表达载体转化及表达产物检测
  • 8. 琼脂扩散法检测重组产物的抗菌活性
  • 三、结果
  • 1. 栉孔扇贝G 型溶菌酶基因cDNA 的克隆
  • 2. 栉孔扇贝G 型溶菌酶基因的cDNA 序列分析
  • 3. 栉孔扇贝G 型溶菌酶CFGLys 的同源性分析
  • 4. 栉孔扇贝G 型溶菌酶的基因结构分析
  • 5. 栉孔扇贝G 型溶菌酶的分子进化研究
  • 6. C型、G 型和I 型溶菌酶的分子进化研究
  • 7. 栉孔扇贝G 型溶菌酶基因CFGLYS 的组织分布
  • 8. 重组质粒的构建及酵母转化
  • 9. 表达产物抑菌活性及抑菌谱的测定
  • 四、讨论
  • 第五章 结论
  • 参考文献
  • 博士期间发表和完成的论文
  • 致谢

    • 相关论文文献

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