论文摘要
目的:以不同方式给小鼠服用不同剂量米非司酮,研究停药后不同时间,米非司酮对小鼠卵泡发育、动情周期及形态学的影响,探讨其引起细胞凋亡的机制,并研究其对卵巢局部生长因子对卵泡调节的影响。方法:105只小鼠随机分组,灌胃方法以不同方式给小鼠不同剂量米非司酮,按照不同停药时间取小鼠卵巢,分组如下:长期小剂量用药组（A1、A2、A3各10只）,间断小剂量用药组（B1、B2、B3各10只）,间断大剂量用药组（C1、C2、C3各10只）。对照组（D1、D2、D3各5只）。利用光镜、电镜、免疫组化、末端标记、荧光定量PCR以及小鼠阴道细胞涂片等方法,观察实验组和对照组小鼠动情周期,卵泡病理结构及超微结构特征,细胞凋亡及相关蛋白Bcl-2/Bax,生长因子IGF-1、IGF-1R,IGF-1R mRNA,GDF-9,BMPR-ⅡmRNA在卵巢的表达。结果:1.动情周期:实验组A1仅有两只小鼠出现动情周期,其余动情周期消失。与对照组D组相比,A2组动情周期明显延长,差异有统计学意义（P＜0.001）。其余各实验组与对照组相比差异无统计学意义。2.卵泡发育:2.1长期小剂量米非司酮用药组:与对照组相比,A1组各级正常卵泡数量显著减少,闭锁率显著增高（P＜0.001）;与对照组相比,A2组各级生长卵泡数量显著减少（P＜0.001）,闭锁率较高,除窦前卵泡以外,其余两型卵泡闭锁率显著增高（P＜0.001）。与对照组相比,A3组正常窦状卵泡无明显差异,其余两型卵泡的数量较少,（P＜0.001）。2.2间断小剂量米非司酮用药组:与对照组相比,B1组原始-初级卵泡数量下降明显（P＜0.001）;窦前和窦状正常卵泡差异无统计学意义;窦前卵泡闭锁率显著增高（P＜0.001）,其余两型卵泡的闭锁率差异无统计学意义。与对照组相比,B2、B3组正常卵泡数和闭锁卵泡率差异无统计学意义。2.3间断大剂量米非司酮用药组:与对照组相比,C1组各级正常卵泡数量均减少（P＜0.001）;其中窦前和窦状卵泡闭锁率显著增高（P＜0.001）。与对照组相比,C2、C3组各级正常卵泡数量和闭锁率差异无统计学意义。3.病理结构:3.1 A1组卵巢结构松散紊乱,原始及初级卵泡少见,绝大部分卵泡内的卵母细胞、大量颗粒细胞坏死,大面积颗粒细胞黄素化出现。A2组见少量结构正常的各级卵泡,各级闭锁卵泡亦多见,可见大面积的或局部的纤维化。部分血管壁增厚扩张,呈显著玻璃样变或纤维素样坏死。A3组见各级卵泡的数量仍较少,但闭锁卵泡较少。仍可见局部的纤维化,部分血管壁仍呈玻璃样变。3.2 B1组各级卵泡数量略少,部分卵泡闭锁。皮质区未见明显纤维化,血管无明显病变。B2、B3组未见明显异常3.3 C1组各级卵泡数量较少,部分卵泡闭锁。皮质区未见明显纤维化,血管无明显病变。C2、C3组:光镜和电镜未见明显异常。4.超微结构:4.1 A1组透射电镜下偶见形态正常的原始-初级卵泡。大部分各级卵泡卵母细胞的胞浆细胞器、微绒毛以及围绕其周围的颗粒细胞出现了一系列变性、坏死。A2组电镜下可见少量形态正常的各级卵泡,多数卵母细胞胞浆细胞器不丰富,线粒体少;颗粒细胞凋亡多见。A3组电镜下可见到少量形态正常的各级卵泡,部分卵泡细胞胞浆细胞器仍不丰富,核仁浓缩。4.2 B1组透射电镜下可见部分形态正常的各级卵泡,部分卵泡胞浆细胞器不丰富,线粒体空泡样变常见。卵母细胞表面微绒毛减少。B2、B3组未见明显异常。4.3 C1组透射电镜下可见部分生长卵泡的卵母细胞核固缩,异染色质极浓密,透明带不规则,间质腺较少,腺细胞核大色浅,胞质内出现较多的空泡。C2、C3未见明显异常。5.除A1组未见典型的TUNEL阳性细胞外,其余组小鼠卵巢部分颗粒细胞表现TUNEL阳性。与对照组相比,A2、B1、C1组凋亡指数增高（P＜0.001）,其余组小鼠颗粒细胞的凋亡指数差异无统计学意义。6.对各组原始-初级卵泡卵母细胞Bax表达的结果发现,各组与对照组相比无显著差异。对各组窦状前卵泡卵母细胞和颗粒细胞Bcl-2/BaX的表达结果发现,与对照组相比,无论在卵母细胞还是颗粒细胞,A2组Bcl-2表达降低,Bax表达升高（P＜0.001）。其余各组Bcl-2和Bax的表达和各自的对照组相比,差异无统计学意义。对各组窦状卵泡卵母细胞Bcl-2和Bax的表达结果发现,与对照组相比,A2组Bcl-2表达降低,Bax表达升高,A3组Bcl-2表达升高（P＜0.001）,其余各组卵泡卵母细胞Bcl-2和Bax的表达差异无统计学意义。对各组窦状卵泡颗粒细胞Bcl-2和Bax的表达结果发现,与对照组相比,A2组Bax表达升高,差异有统计学意义（P＜0.001）,其余各组颗粒细胞Bcl-2和Bax的表达差异无统计学意义。7.IGF-1、IGF-1R在长期用药组小鼠卵巢颗粒细胞的表达,A1组显著低于对照组（P＜0.001）,其余各组与对照组相比,差异无统计学意义。IGF-1RmRNA在长期用药组小鼠卵巢相对定量结果显示,与对照组相比,A1、A2组表达量明显降低（P＜0.001）,A3组差异统计学意义。8.GDF-9在长期用药组小鼠卵巢卵母细胞的表达,在窦前卵泡的卵母细胞,GDF-9在A2组卵母细胞的表达明显低于对照组（P＜0.001）,A3组的表达与对照组相比差异无统计学意义。在窦状卵泡,GDF-9在A2组卵母细胞的表达明显低于对照组（P＜0.001）,A3组的表达和对照组相比差异无统计学意义。BMPR-ⅡmRNA在长期用药组小鼠卵巢相对定量结果显示,与对照组相比,A1组表达量明显降低（P＜0.001）,A2、A3组差异无统计学意义。结论1.长期小剂量米非司酮对小鼠卵巢功能的影响不仅表现为抑制卵泡的发育,引起内分泌功能的紊乱,还表现为对卵泡细胞的损伤,这种损伤随着停药时间的延长会得到不同程度的恢复。小剂量米非司酮间断用药及大剂量间断用药对小鼠卵泡发育的影响表现为暂时的抑制作用,而非不可逆的损伤作用。2.米非司酮可能通过影响凋亡相关蛋白的表达干扰卵泡的正常生长和卵巢功能,米非司酮导致卵泡闭锁（尤其在晚期卵泡）的主要原因是引起颗粒细胞的凋亡。随停药时间的延长,不同组别颗粒细胞凋亡指数的下降及凋亡相关蛋白表达的变化,说明米非司酮抑制卵巢功能在一定程度上是可复的,但是时间依赖性的。3.在长期小剂量用药组,米非司酮可通过抑制IGF-I及其受体IGF-IR,干扰卵泡的正常生长,影响颗粒细胞增殖。但随停药时间延长,受抑制的IGF-I及其受体的表达可恢复正常,卵泡受到的抑制和损害也可以得到不同程度的恢复。4.在长期小剂量用药组,米非司酮可通过干扰GDF-9及其受体的表达与调控,影响卵母细胞的生长与成熟,并影响卵母细胞对卵泡生长的调节作用。随停药时间的延长,GDF-9及其受体的表达可恢复正常。
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