李属坏死环斑病毒CN-Huairou分离物的初步研究及种苗传毒风险模拟评估

论文摘要

李属坏死环斑病毒（Prunus necrotic ringspot virus, PNRSV）是我国1992年公布的进境二类检疫危险性有害生物,本研究采用生物学、血清学和反转录PCR检测方法对采集于北京核果主产区怀柔、平谷的樱桃、杏、桃和李树叶片共70份样品进行了检测,结果在怀柔地区发现了李属坏死环斑病毒。 将检测阳性的樱桃叶片的研磨汁液摩擦接种于鉴别寄主黄瓜上,分离得到该病毒的一个分离物,定为CN-Huairou。本研究对该分离物,通过RT-PCR扩增、连接pMD18-T载体、转化大肠杆菌DH5α,克隆了该分离物的外壳蛋白基因片断,并进行了测序分析。 序列分析结果表明,李属坏死环斑病毒CN-Huairou分离物与德国酸樱桃上分离的Ring17和4-8同源性达到100%,该分离物核苷酸在第118～125bp间有6bp核苷酸序列差异,表现在氨基酸上为第39～42aa间有两个氨基酸差异;该分离物CP基因的第62、81和126位氨基酸分别与PNRSV CH9血清型温和致病型相应氨基酸相同。将所获得的分离物与47个其他地区的分离物,特别是我国分离到的11个分离物进行同源性和进化树分析,48个分离物的氨基酸序列同源性为89%～100%,我国12个分离物的同源性在93%～100%,属于三个不同的组,除CN-Huairou、CN-Changli属于Hammond划分的表现温和症状的Group Ⅱ（PV96）,CN-Hangzhou属于GroupⅢ（PE5）外,其他9个分离物均属于Group Ⅰ（PV32）,且分离物间不表现明显的地域相关性或寄主相关性。 本研究基于Monte Carlo模拟理论,利用Delphi7.0开发了有害生物风险评估系统PRAS,该系统可以通过场景分析、数学模型构建和随机模拟对有害生物风险进行定量评估。利用PRAS对种苗传毒风险进行了模拟评估,不同引种数量、不同带毒率对种苗传毒风险的模拟评估结果表明,在10000次引种模拟中,达到种苗传毒零风险需要满足:种苗带毒率在0～1%时,引种限量应在0～250株;种苗带毒率在1.1～2%时,种苗引种限量在0～100株:种苗带毒率在2.1%～5%时,种苗引种限量应为0～50株;在国家规定的引种限量内,果树种苗带毒率<=0.4%、木本花卉种苗带毒率<=1%时,病毒随种苗传入风险为零。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 1.1 植物病毒研究方法
• 1.1.1 生物学研究方法
• 1.1.2 血清学方法
• 1.1.3 组织细胞学方法与电子显微镜技术
• 1.1.4 分子生物学技术
• 1.2 李属坏死环斑病毒研究进展
• 1.2.1 危害与分布
• 1.2.2 病毒粒体特性与株系
• 1.2.3 传播途径
• 1.2.4 检测方法研究
• 1.3 有害生物风险分析
• 1.3.1 法规政策
• 1.3.2 有害生物风险评估的方法和技术
• 1.3.3 有害生物风险评估研究进展
• 1.4 研究目的和意义
• 1.5 主要研究内容
• 第二章 PNRSV怀柔分离物CP基因片断克隆与序列分析
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 双抗体夹心酶联（DAS-ELISA）法检测
• 2.2.2 生物学检测
• 2.2.3 反转录PCR扩增法检测
• 2.2.4 外壳蛋白基因片断克隆与序列分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 DAS-ELISA法检测李属坏死环斑病毒
• 2.3.2 生物学检测李属坏死环斑病毒
• 2.3.3 RT-PCR检测李属坏死环斑病毒
• 2.3.4 李属坏死环斑病毒怀柔分离物外壳蛋白基因片断克隆与序列分析
• 2.4 小结
• 第三章 有害生物风险评估系统（PRAS）的开发
• 3.1 系统定义
• 3.2 开发工具与平台
• 3.3 系统的总体设计
• 3.4 系统界面设计
• 3.5 PRAS的文件系统
• 3.6 功能模块
• 3.6.1 有害生物的定量风险评估模块
• 3.6.2 高风险有害生物的筛选模块
• 3.7 系统的应用环境
• 第四章 种苗传毒风险模拟评估
• 4.1 分析工具
• 4.2 植物病毒随种苗传入风险模拟研究
• 4.2.1 场景分析
• 4.2.2 数学模型或随机过程的构建
• 4.2.3 随机模拟
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 传入风险影响因子模拟随机数检验
• 4.3.2 植物病毒随种苗传入风险模拟评估
• 4.4 小结
• 第五章 结论与讨论
• 5.1 主要研究结果
• 5.1.1 北京怀柔区樱桃上发现李属坏死环斑病毒
• 5.1.2 李属坏死环斑病毒怀柔分离物CP基因序列分析
• 5.1.3 我国12个李属坏死环斑病毒分离物CP基因序列分析
• 5.1.4 种苗传毒风险模拟评估
• 5.2 讨论
• 5.2.1 有关李属坏死环斑病毒摩擦接种的探讨
• 5.2.2 对我国李属坏死环斑病毒的讨论
• 5.2.3 PNRSV的后续研究
• 5.2.4 对风险评估系统PRAS的讨论
• 5.2.5 对种苗传毒风险评估的讨论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 作者简历