柑橘速衰病毒的遗传多样性研究

论文摘要

由柑橘速衰病毒（Citrus tristeza virus，CTV）引发的柑桔速衰病是全世界柑桔生产中破坏力最强、经济意义最为重要的病害之一。它主要危害以酸橙作砧木的柑桔，也能引起葡萄柚和某些甜橙品种的茎陷和果实变小等症状。本研究应用RT-PCR、单链构象多态性（Single-strand conformation polymorphism，SSCP）、DNA测序和系统发育分析等方法，目的是要调查我国柑橘CTV感染的基本情况，比较不同分离物的序列特征，探索CTV的系统进化关系，最终为开发分子标记鉴定我国CTV株系提供理论指导。结果如下： 1．以随机采样的方式，从湖北、湖南和江西3省10县的柑橘产区收集242份温州蜜柑（Citrus unshiu Marc．）、橘（C．reticulata Blanc．）、甜橙（C．sinensis Osb．）)和柚（C．grandis Osb．）样品。对PAS-ELISA法检测呈阳性的样品进行CTV的CP（Coating protein，CP）基因的RT-PCR扩增，结果来自14个样品采集地的120份样品感染了CTV，单个采样点的感染率为20.0％-71.4％，总感染率达49.6％，表明CTV在这些地区已经广泛分布。SSCP分析显示，120份CP基因的RT-PCR扩增产物共产生120种SSCP谱型，每一种谱型含有2-7条不等的单链DNA带，暗示这些样品采集地区存在广泛的CTV混合感染。 以CTAB-LiCl法制备的总RNA为模板，可以对柑橘进行CTV的RT-PCR检测。该法制备总RNA的过程简单，成本低廉。 2．以柑橘叶片总RNA为模板，用RT-PCR扩增CP基因，扩增产物经克隆与测序证实，来自湖南道县和江西崇义3份橘的实牛苗样品（HN、JX-1和JX-2）都感染了CTV。通过扩增产物克隆前和克隆后的PCR-SSCP分析，发现来自HN和JX-1的CP基因各自只含有1种独特的序列，来自JX-2的序列则含有2种主要的序列。这表明来自3份样品的CTV的CP基因不仅存在序列变异，而且样品JX-2的CTV群体可能因为混合感染而呈异质性。 通过双向测序和序列分析，4个CP基因序列都没有碱基插入、缺失或终止密码子插入，含有完整的翻译区。核苷酸序列比对分析表明，4个克隆之间的相似性为93％-98％；克隆HN-K与葡萄牙分离物28C、以色列茎陷分离物VT的相似性都达到98％；克隆JX-1-1与印度茎馅分离物Pune和Bangalore的相似性都在98％以上；克隆JX-2-7、JX-2-17与日本苗黄分离物NUagA和美国加利福尼亚严重茎陷分离物SY568的相似性也在97％-98％之间。4个克隆与佛罗里达速衰分离物T36、弱毒分离物T30和西班牙弱毒分离物T385的相似性仅有91％-93％。系统树分析显示，4个中国克隆分属3个不同的分支，每个分支由中国克隆和地理来源不同的茎陷或苗黄分离物组成。 3．以SSCP分析显示CTV混合感染程度较轻的江西省于都县的1份甜橙样品为材

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 文献综述
• 1.1 柑桔速衰病（Citrus tristeza disease）
• 1.2 柑桔速衰病毒 （Citrus tristeza virus,CTV）
• 1.2.1 分类地位
• 1.2.2 病毒粒子的形态特征
• 1.3 CTV的生物学特性
• 1.3.1 寄主范围
• 1.3.2 细胞病变效应
• 1.3.3 病理学症状
• 1.3.4 传播
• 1.4 CTV的分子生物学
• 1.4.1 基因组结构
• 1.4.2 基因特征与功能
• 1.4.3 复制
• 1.4.4 缺陷性RNA
• 1.4.5 基因表达策略
• 1.4.5.1 多聚蛋白的加工
• 1.4.5.2 亚基因组RNA
• 1.4.5.3 翻译移码
• 1.5 CTV的分了变异
• 1.5.1 非对称的序列变异性
• 1.5.2 5′端和3′端UTR的序列变异性
• 1.5.3 CP基因的序列变异性
• 1.6 CTV的株系鉴定
• 1.6.1 多克隆抗体技术
• 1.6.2 RT-PCR扩增技术
• 1.6.3 核酸探针杂交技术
• 1.6.4 SSCP电泳技术
• 1.7 CTV的控制
• 1.7.1 弱毒株系的交叉保护
• 1.7.2 遗传工程抗性
• 2 选题依据
• 3 材料与方法
• 3.1 试剂和仪器
• 3.1.1 试剂
• 3.1.2 仪器
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.1.1 试验样品
• 3.2.1.2 抗体及标准毒源
• 3.2.1.3 菌株与载体质粒
• 3.2.1.4 电泳缓冲液和细菌培养基
• 3.2.2 方法
• 3.2.2.1 PAS-ELISA检测
• 3.2.2.2 CP、p23和RdRp等基因的RT-PCR扩增
• 3.2.2.3 RT-PCR-SSCP分析
• 3.2.2.4 RT-PCR产物克隆
• 3.2.2.5 PCR-SSCP分析
• 3.2.2.6 序列测定和分析
• 4 结果与分析
• 4.1 CTV的遗传多样性分析
• 4.1.1 ELISA检测结果
• 4.1.2 RT-PCR扩增结果
• 4.2 橘实生苗分离物的CP基因序列分析
• 4.2.1 RT-PCR检测结果
• 4.2.2 RT-PCR扩增产物的克隆
• 4.2.3 RT-PCR-SSCP和PCR-SSCP分析结果
• 4.2.4 测序与序列分析结果
• 4.3 江西于都甜橙分离物的序列分析
• 4.3.1 RT-PCR扩增结果
• 4.3.2 PCR-SSCP分析结果
• 4.3.3 序列比对和进化分析结果
• 4.3.3.1 CP基因
• 4.3.3.2 p23基因
• 4.3.3.3 RdRp基因5′端序列
• 5 讨论
• 5.1 柑橘组织总RNA提取
• 5.2 目的序列RT-PCR扩增的引物设计
• 5.3 CTV的RT-PCR检测
• 5.4 SSCP分析CTV的遗传变异和混合感染
• 5.4.1 SSCP分析CTV的遗传变异
• 5.4.2 SSCP分析CTV的混合感染
• 5.5 CTV的系统进化分析
• 5.6 CP、p23和RdRp等基因的序列多态性分析
• 5.6.1 SSCP在基因克隆中的应用
• 5.6.2 CP、p23和RdRp等基因的序列变异性比较
• 5.6.3 序列多态性在CTV株系鉴定中的应用
• 6 参考文献
• 附录
• 致谢