论文摘要
植物体内的Rho家族小G蛋白（ROP）参与了植物生长的各个发育过程。研究表明ROPs在包括叶表皮细胞在内的植物细胞的形态建成过程中发挥着重要的作用。ROPs可以通过调控下游的微丝和微管细胞骨架的排列影响细胞的形态。但是作为Rho GTPases信号通路的一类重要调控因子,如RhoGDIs（GDIs）在这些过程中发挥的作用还有待研究。GDI最初被发现是因为它可以将GDP形式的Rho GTPase滞留在细胞质内,即：抑制GDP形式的Rho GTPases的释放,阻滞GDP-Rho GTPases被置换成为GTP-Rho GTPases的可能性,从而影响Rho GTPases的功能。因此,多数观点认为GDI它在Rho GTPase信号通路中起负调控的作用。近期关于动物细胞中GDI1的研究使人们认识了GDI的另一种功能,即：GDI还可以通过促进Rho GTPase的膜-质循环帮助Rho GTPase进行恰当的胞质功能定位,实现RhoGTPases的功能：由此可见GDI其实在某种程度上起到了正调节的作用。迄今为止,人们对于植物细胞中GDIs对ROPs功能的调控机制知之甚少。虽然植物GDI1在根毛生长和花粉管伸长中的作用已经有了一些研究,但是对于它是否参与了植物的形态发生与建成、是否具有广泛的调控作用,亟待研究。此外,植物细胞中的GDI是如何被调控的,一直不得其解。在我们的研究中,证明了GDI1在调控拟南芥植株形态建成以及叶表皮细胞形态发生过程中起到了重要的作用。不仅如此,我们还解答了GDI1行使功能的机理,证明了钙离子依赖蛋白激酶CPK3磷酸化修饰GDI1对于GDI1的活性起到了关键性的调节作用。同时,我们还鉴定出了GDI1蛋白上的关键磷酸化位点并验证了它们对GDIl磷酸化水平的作用、对细胞和植株形态建成的影响。此外,我们还对叶表皮的一类特殊细胞（即保卫细胞）中的GDI1的调节作用进行了深入地研究。重点探讨了GDI1参与保卫细胞ABA信号传导的功能,阐明了GDIl对于ABA诱导的气孔关闭过程中微丝细胞骨架重排的机理。通过对几个ABA通路关键因子（PYR、ABI1、SnRK2.6和GDI1）的体外重建实验,我们证明了ABA可以直接通过对SnRK2.6激酶活性的激活促进它对GDI1的磷酸化,从而提高GDI1抑制ROP-GDP解离的活性,行使其负调控因子的功能进而达到抑制ROP信号传导的目的,最终导致微丝细胞骨架的解聚。我们的主要结果包括以下几点：1)通过对gdil-1突变体以及GDI1超表达转基因植株（如GDI1-14株系）的表型分析,证明了GDI1在植物形态建成以及叶表皮细胞形态发生过程中的重要作用。2)通过蛋白质体外Pull-down和双分子荧光互补实验证明了GDI1可以和多个ROP结合,无论是GDP形式的还是GTP形式的ROP都可以同GDI1结合。进一步的体内FRET（荧光共振能量转移）实验检测了GDI1和ROP2以及ROP6在叶表皮细胞中的相互作用特点,结果表明GDI1和ROP2的结合均匀分布在整个细胞的细胞膜以及膜周边的细胞皮层区域；而GDI1和ROP6的结合则主要分布在叶表皮细胞顶端凸起处的细胞质中。因此我们的结果证明GDI1可能通过与各种ROP不同的空间结合方式来调控各ROP下游分支信号,从而达到对叶表皮细胞形态发生的调控。3)GDI1的超表达可以导致表皮细胞中微丝的成束,这与ROPs超表达所产生的效应类似。反之,在gdiI-突变体中,微丝的排列却紊乱无序。微管细胞骨架在gdi1-1突变体和GDI1超表达植株中的排列也与野生型细胞中的不同,野生型叶表皮细胞凹陷处的整齐横向排列的微管构架在gdi1-1突变体和GDI1超表达植株中均被改变,变成了紊乱无序的排列。4)GDI1-14叶表皮细胞的异常形态在CA-rop6遗传背景下更加明显,杂交株系GDI1CA-rop6中的叶表皮细胞的异常形态更加明显。在GDI1ROP6-WT杂交株系中,异常的叶表皮形态得以部分恢复,而在GDI1DN-rop6杂交植株中能够得到完全恢复。5)利用质谱分析鉴定出了GDI1蛋白质三个磷酸化位点（Ser45、Ser48以及Thr52）,它们均位于GDI1蛋白的N端区域。GDI1的磷酸化可以增强其与ROP2、ROP6以及ROP10的结合。虽然突变这三个磷酸化位点,即将GDI1（3A）在与GDI1野生型蛋白同等超表达的情况下,并没有引发同样强烈的表皮细胞异常发育的表型,可是GDI1（3A）的表达却能够严重影响子叶的发育,在GDI1（3A）转基因植株中出现了单片子叶,融合子叶和三片子叶的现象。6)证明了钙离子依赖蛋白激酶CPK3可以和GDI1结合并将GDI1磷酸化。胞内钙离子通道抑制剂处理说明钙离子水平影响叶表皮细胞的形态发育,暗示钙离子信号和CPKs对于ROP信号传导的影响。7)通过对叶表皮保卫细胞运动的检测实验,我们发现缺失gdil突变体的气孔关闭对ABA的敏感性呈现出明显降低的趋势。在ABA处理后,gdil突变体的气孔关闭程度较野生型的小。反之,GDI1超表达转基因植株（GDI1-14株系）的气孔对ABA处理更加敏感,这种超敏感表型在GDl1DN-rop6杂交植株中消失。8)实时观察分析了气孔中微丝骨架对ABA的响应。从不同时间节点记录了ABA诱导保卫细胞微丝重排的过程,总结出微丝重排的变化进程。ABA处理后,保卫细胞中的微丝束由原横向排列逐渐变为纵向排列；微丝束解聚,成束的微丝结构迅速减少；保卫细胞体积明显变化,气孔开度随之减小最终关闭。9)分析比较了野生型与GDl1缺失突变体scn1-1十片的保卫细胞中微丝排列表型。结果发现,缺失突变体scn1-1的保卫细胞对于ABA呈现不敏感,其中的微丝骨架变化与野生型相比在ABA处理后变化不明显。经ABA处理后,scn1-的保卫细胞中大部分微丝仍呈横向辐射状排列。10) GDI1的三个磷酸化位点均能够被SnRK2.6磷酸化。GDI1蛋白的磷酸化修饰使得它对ROP上GDP的解离具有了更强的抑制作用,从而可以更大程度地抑制了ROP信号传导通路。11)ABA促进SnRK2.6对GDI1的磷酸化。通过体外重建和磷酸化实验证明ABA可以通过信号通路中的关键因子,如PYR1、ABI1和SnRK2.6来调节GDI1的功能。ABA受体PYR1的激活能够抑制ABI1（PP2C类磷酸酶）的活性,这样极具活性的磷酸激酶SnRK2.6便可以对GDI1进行磷酸化修饰,从而调节GDI1的功能。