生防芽孢杆菌物种与分子遗传多样性研究

论文摘要

黄曲霉毒素（Aflatoxin）作为所有已知天然物质中毒性最强,致癌效力最大的物质,始终严重威胁着人类的健康,同时因其难以去除而且能够通过污染饲料而侵染乳制品或肉类食物,严重困扰着食品工业的发展。花生是我国的主要油料作物之一,因其容易受潮发生霉变而受到黄曲霉毒素侵染,不仅危害了我国的花生食品和食用油安全,而且直接影响了我国的花生种植业经济发展和花生的外贸出口。本研究对从花生荚果际中筛选出的黄曲霉毒素生防细菌进行复筛,并选出52株生防细菌进行种属鉴定。在生防细菌的常规鉴定中发现所选取的生防细菌在pH为中性的培养基的平板上划线后,在35℃下无菌通风培养时生长良好,所得到的菌落形态可以分为5大类,有典型的皱醭状、典型的滴蜡状等。在对生防细菌进行革兰氏染色和芽孢染色后镜检发现,有37株生防细菌为产芽孢的革兰氏阳性杆菌,15生防细菌株为不产芽孢的革兰氏阴性杆菌。在镜检中测量了各个菌株的菌体大小。可以推断出37株产芽孢的革兰氏阳性杆菌主要属于芽孢杆菌属（Bacillus）等。选取了37株产芽孢的革兰氏阳性杆菌进行抑菌抑毒活性研究,测定了它们对黄曲霉毒素前体（NA）积累的抑制作用和对寄生曲霉菌丝体生长的抑制作用。得到了20株对黄曲霉毒素前体（NA）抑制率达到100%的生防芽孢杆菌,和10对寄生曲霉菌丝体生长抑制率在80%以上的生防芽孢杆菌,并且通过将二者结合分析,找到了7株抑菌抑毒活性最好的生防芽孢杆菌（菌丝体抑制率>85%、NA抑制率100%）,以及数株在能够完全特异性抑制NA产生的同时,对寄生曲霉菌丝生长有不同程度抑制能力的菌株。对所选取的37株生防芽孢杆菌进行了16S rDNA分子鉴定,并且在分析菌株的最高相似度序列的同时构建生防芽孢杆菌的进化树。通过结合分析16S rDNA的分子鉴定结果和进化树,发现所选取的生防芽孢杆菌都属于芽孢杆菌（Bacillus）属,其中枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为优势种,达到27株,占到所选菌株的65%。第二大种为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）,有5株。还存在2株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、2株苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）、1株地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。对37株生防芽孢杆菌进行16S-23S IGS PCR-RFLP分子,使用了7种限制性内切酶,分别为Hinf I、Hae III、Rsa I、Cfo I（Hha I）、Dde I、Tru9 I、Nde II（Mbo I）。得到了多样性显著且具有规律性的聚类群树状图。对聚类群树状图综合分析,不仅进一步验证和完善了生防芽孢杆菌的16S rDNA分子鉴定,且得到了生防芽孢杆菌的分子遗传多样性及聚类群结果,分析发现同种菌的不同菌株在遗传多样性上非常丰富,2株蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）和2株苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）组成的菌群在相似性65%水平上与主要为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的菌群分离出来。而枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的菌群中各个菌株之间存在丰富的分子遗传多样性。本研究所采用的种属鉴定方法简洁高效,在抑菌抑毒活性研究中所使用的研究方法与实践应用结合紧密,有利于将研究成果应用到食品工业生产,为黄曲霉生物防治的进一步研究打下了良好的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 课题背景
• 1.1.1 黄曲霉毒素及其危害
• 1.1.2 黄曲霉毒素污染对我国花生产业的影响
• 1.1.3 防治黄曲霉毒素污染的主要方法
• 1.2 黄曲霉毒素生物防治的国内外研究进展及应用
• 1.2.1 生物竞争抑毒技术及其应用
• 1.2.2 微生物及其代谢产物降解黄曲霉毒素
• 1.3 课题来源及研究目的和内容
• 1.3.1 课题来源
• 1.3.2 研究目的与研究内容
• 第2章 生防细菌的常规鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验主要仪器
• 2.1.2 试验主要药品及试剂
• 2.1.3 供试菌株
• 2.1.4 试验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 菌落特征观察
• 2.2.2 菌体特征观察
• 2.3 本章小结
• 第3章 生防芽孢杆菌的抑菌抑毒活性研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验主要仪器
• 3.1.2 试验主要药品及试剂
• 3.1.3 供试菌株
• 3.1.4 试验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 生防细菌液体发酵特性
• 3.2.2 生防细菌的抑菌抑毒活性研究
• 3.3 本章小结
• 第4章 生防芽孢杆菌的16S RDNA序列分析与分子鉴定
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验主要仪器
• 4.1.2 试验主要药品及试剂
• 4.1.3 供试菌株
• 4.1.4 试验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 16S rDNA序列扩增
• 4.2.2 分子鉴定与物种多样性分析
• 4.2.3 进化树的构建
• 4.3 本章小结
• 第5章 生防芽孢杆菌16S RDNA IGS RFLP分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 试验主要仪器
• 5.1.2 试验主要药品及试剂
• 5.1.3 供试菌株
• 5.1.4 试验方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 16S-23S IGS 序列的扩增
• 5.2.2 酶切电泳检测结果
• 5.2.3 酶切图谱数据分析
• 5.3 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的论文及其他成果
• 致谢