超声激活血卟啉诱导艾氏腹水瘤细胞凋亡的相关研究

论文摘要

在威胁人类生命健康的疾病中，癌症首当其冲。谈癌色变，为此人类在积极努力的探索攻克癌症的方法。就目前而言，治疗癌症的方法有很多种，如手术治疗、放疗、化疗等，以超声激活血卟啉的声动力学疗法就是其中之一。声动力学疗法（Sonodynamic therapy，SDT）是日本学者Umemura于1989年提出的抗癌新方法。该疗法是利用超声具有穿透深部组织并能聚焦于肿瘤部位的特性，激活相对无毒性且长时间富集于肿瘤组织的声敏剂，从而产生抗肿瘤因子杀伤肿瘤细胞。由于声敏剂对肿瘤细胞的聚集性和外部超声波的选择性而对健康组织基本没有损害，因此对一些不能手术切除或需要化疗的患者尤为适宜。随着对声动力学疗法研究的深入，国内外学者就SDT抗肿瘤的作用机制开展了多学科的研究工作，并取得了一定成果，提出了一系列声空化、自由基、脂质过氧化等理论机制，但具体机制目前尚无定论。SDT可能受多种因素的影响，不同的声敏剂、超声参数以及所研究的生物系统模型都可能共同决定着其抗肿瘤的机制和疗效。就其生物学机制而言，有直接损伤肿瘤组织细胞结构和功能的杀伤机制以及诱导肿瘤细胞凋亡的模式。本论文在综合国内外研究进展的基础上，结合本实验室前期研究成果，依托国家自然科学基金项目“超声激活血卟啉抗肿瘤的细胞分子生物学机制”和“超声激活血卟啉诱导肿瘤细胞凋亡的分子生物学机制”的支持，采用频率为1．34 MHz的超声结合50μg／mL血卟啉对艾氏腹水瘤细胞的凋亡作用机制进行研究，目前取得的实验结果如下：1．超声结合血卟啉检测艾氏腹水瘤细胞存活率的结果表明：单纯血卟啉组对艾氏腹水瘤细胞几乎没有影响；而单纯超声组对细胞存活率的影响较对照组高；超声结合血卟啉组对细胞存活率的影响进一步增加，与单纯超声组相比，经差异显著性分析，其P值<0．01，可见超声结合血卟啉组对艾氏腹水瘤细胞有明显的影响。2．超声结合血卟啉对艾氏腹水瘤细胞的形态学研究：扫描电子显微镜观察细胞表面超微结构的变化，对照组艾氏腹水瘤细胞呈圆球形，表面有丰富细密的微绒毛。单纯血卟啉组较对照组比无明显变化。单纯超声组0h取材的部分细胞表面的微绒毛数量减少，细胞稍有形变且在细胞表面有少量的指状突起；1h取材的超声组细胞表面微绒毛数量大量减少，形变更为明显；3h取材的细胞膜上已出现孔洞，微绒毛几乎没有。超声结合血卟啉组0h取材的细胞表面微绒毛数量减少，形态以层状、片状突起为主；1h取材的部分细胞表面变的较为光滑，而且出现了凋亡小体；3h取材的细胞中部分细胞受损程度加大，形变极为剧烈，泡状突起增多。透射电镜观察显示，对照组细胞膜完整，细胞表面微绒毛丰富，胞质浓缩，细胞器结构完整。血卟啉组细胞形态结构与对照组相近。单纯超声组0h取材，胞膜完整，胞质均一但稍有变稀，胞质内有很多小泡形成，双层核膜完整；1h取材，胞质内空隙增多，胞质空泡增大，核膜依然完整，部分细胞核内形成空区；3h取材，大多数细胞形态极度变形，核膜边界模糊，核内大量空化泡产生。超声结合血卟啉组，0h取材的细胞胞膜完整，胞浆丰富，胞质有大量空泡，核膜结构完整清晰；当1h取材时，部分细胞胞膜有破损，胞质受损，胞浆有大量空泡状结构，核物质不均一，部分核内形成空区，胞膜有许多的指状突起；3h取材部分胞膜凸起有类似凋亡小体的结构出现。Hoechst 33342核荧光染色显示，对照组肿瘤细胞核为弱蓝色荧光，呈圆球形。单纯血卟啉组细胞核亦呈弱蓝色荧光。单纯超声组0h取材，多数细胞与对照组相似，核为弱蓝色荧光；1h取材，少数细胞的核呈蓝色荧光，细胞核稍有变形；3h取材的细胞多数细胞核发生形变，部分细胞蓝色荧光有所增强。超声结合血卟啉组0h取材细胞呈蓝色荧光；1h取材的细胞荧光程度增强；3h取材的细胞核明显形变，大部分细胞核呈现强荧光染色。3．免疫细胞化学方法检测四种凋亡相关蛋白Fas、FasL、caspase-8、caspase-3的活性变化情况。实验结果发现，对照组及单纯血卟啉组细胞凋亡相关蛋白的平均光密度值没有明显变化；单纯超声作用于艾氏腹水瘤细胞后随着时间的延长，细胞中凋亡相关蛋白的平均光密度值有变化，但是变化不显著；超声结合血卟啉组凋亡相关蛋白的平均光密度值明显改变。4．荧光显微镜观察FADD转定位实验结果表明：对照组、血卟啉组及单纯超声组的细胞绿色荧光分布均匀，说明FADD定位于胞浆中，其分布没有发生变化。超声结合血卟啉组细胞FADD的变化比较明显，处理后0、1小时取材，FADD的荧光分布均变得弥散、无序，少数细胞的细胞膜有较强的绿色荧光；3小时后超声结合血卟啉组半数以上细胞的细胞膜有绿色荧光，且部分细胞表面有明显的膜发泡现象，FADD由胞浆向胞质中转定位。这一结果进一步提示超声激活血卟啉诱导艾氏腹水瘤细胞凋亡的过程中可能存在caspase-8依赖的Fas／FasL死亡受体途径。5．对细胞膜Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活力的测定结果表明：CT组与H组比较，细胞膜Na+-K+-ATPase以及Ca2+-Mg2+-ATPase活力无明显差异，P>0．05；与CT组和H组比较，U组的Na+-K+-ATPase以及Ca2+-Mg2+-ATPase活力均有明显的下降，P<0．05；与CT组和H组比较，UH组的Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活力下降极显著，P<0．01；与U组比较，UH组的Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活力呈极显著性下降，P<0．01。本论文选择血卟啉为声敏剂研究声动力学疗法抗肿瘤的特性，通过超声激活血卟啉对艾氏腹水瘤细胞凋亡模式的相关研究，初步探讨了声动力学疗法抗癌的细胞分子生物学机制，以期为声动力学疗法提供理论基础，从而为声动力学疗法早日应用于肿瘤的临床诊断和治疗积累相关资料。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 声动力学疗法研究进展
• 1.2 影响声动力学疗法的主要因素
• 1.2.1 超声波
• 1.2.2 声敏剂
• 1.2.3 其他
• 1.3 声动力学疗法抗肿瘤的作用机制
• 1.3.1 超声空化效应
• 1.3.2 单线态氧机制
• 1.3.3 自由基理论
• 1.3.4 诱导细胞凋亡
• 1.4 声动力学疗法的发展方向
• 第2章 论文的立论依据、内容及目的意义
• 第3章 超声激活血卟啉对艾氏腹水瘤细胞凋亡的相关研究
• 3.1 超声激活血卟啉对艾氏腹水瘤细胞相对存活率的影响
• 3.2 超声激活血卟啉对艾氏腹水瘤细胞的形态学研究
• 3.2.1 超声激活血卟啉对艾氏腹水瘤细胞的扫描电镜观察
• 3.2.2 超声激活血卟啉对艾氏腹水瘤细胞的透射电镜观察
• 3.2.3 荧光显微镜观察声动力处理后细胞核显微结构的变化
• 3.3 超声激活血卟啉对艾氏腹水瘤细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、Fas、FasL、Caspase-8的检测
• 3.4 超声激活血卟啉对艾氏腹水瘤细胞FADD蛋白转定位的研究
• +-K⁺-ATPase、Ca²⁺+Mg²⁺-ATPase活力的影响'>3.5 超声激活血卟啉对艾氏腹水瘤细胞Na⁺-K⁺-ATPase、Ca²⁺+Mg²⁺-ATPase活力的影响
• 结论
• 参考文献
• 图版及图版说明
• 致谢
• 攻读硕士学位期间的研究成果