来源于青霉F63的α-半乳糖苷酶的纯化、基因克隆、表达与性质研究

论文摘要

α-半乳糖苷酶（alpha-galactosidase,EC 3.2.1.22）是催化α-半乳糖苷键水解的酶类,广泛的分布于植物、动物和微生物体内。它不但可以催化α-半乳糖苷类的寡糖,还可以催化含α-半乳糖苷键的多聚糖。该酶在饲料、食品、造纸和医药工业等领域具有广泛的应用前景。然而目前α-半乳糖苷酶主要是从天然菌株中分离得到,产量较低,成本较高,从而限制了α-半乳糖苷酶的生产应用。因此利用微生物学和分子生物学的原理和手段,克隆α-半乳糖苷酶基因,构建高效表达和分泌的基因工程菌株来提高α-半乳糖苷酶产量,降低生产成本是解决随这一问题的有效途径。 本研究利用硫酸铵沉淀、阴离子交换层析、分子筛层析和电泳技术从青霉F63中分离纯化到一种α-半乳糖苷酶Agl1,该酶的分子量为330kDa,亚基分子量为82kDa,该蛋白是由相同亚基组成的一种四聚体。经过MALDI-TOF-MS鉴定和ESI-MS/MS测序分析,该蛋白为一种新的α-半乳糖苷酶。利用所测的两段内肽的氨基酸序列,设计简并引物,以青霉基因组DNA为模板PCR扩增得到了α-半乳糖苷酶的一段核苷酸序列。根据克隆到的α-半乳糖苷酶的核苷酸序列设计引物,通过反向PCR技术得到了该基因的5’上游和3’下游序列。根据该α-半乳糖苷酶的基因组序列,设计恰当的引物,以青霉F63菌丝体总RNA为模板,通过RT-PCR克隆到该α-半乳糖苷酶cDNA的全长序列。通过测序证明该α-半乳糖苷酶基因内部是没有内含子的。该α-半乳糖苷酶基因的开放阅读框架（ORF）为2205bp,GTG被推定为该基因的起始密码子,编码一个含有734个氨基酸的酶蛋白,N端21个氨基酸为该α-半乳糖苷酶的信号肽序列。推测该酶的理论分子量为78.5kDa,理论pI为5.07。在成熟蛋白的氨基酸序列中,有7个潜在的糖基化位点。与其它的α-半乳糖苷酶的氨基酸序列进行比较发现该α-半乳糖苷酶的氨基酸序列与黑曲霉的序列一致性最高,达到69.6%。该α-半乳糖苷酶与已知的青霉的α-半乳糖苷酶的氨基酸序列比较,发现它们的序列一致性较低,与紫青霉和单青霉的氨基酸序列一致性分别为7.5%和8.2%。这是首次从青霉属中克隆到糖基水解酶36家族的α-半乳糖苷酶基因。 将编码α-半乳糖苷酶成熟蛋白的序列克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中,电击转化宿主菌GS115,利用α-半乳糖苷酶底物（pNPG）平板筛选阳性转化子。从100个转化子中筛选到了23株表达α-半乳糖苷酶的重组子,其中56#转化子在3L发酵罐水平表达量约为0.2mg/mL发酵液,α-半乳糖苷酶的酶活力达111U/mL,约为国外最高酶活力的2倍,是国内构建的α-半乳糖苷酶基因工程菌株的3倍。 将重组α-半乳糖苷酶和天然α-半乳糖苷酶进行纯化并进行了酶学性质的研究。天然酶的最适温度为45℃,重组酶的最适pH为40℃。天然酶与重组酶的最适pH都为5.0。重组酶与天然酶对高温都较敏感。天然酶在pH5.0-6.0之间具有良好的pH稳定性,而重组酶在pH6.0-6.5之间具有良好的pH稳定性,它们在常温作用12h后,剩余酶活力都大于88%。天然酶的比活为106.4U/mg,重组酶的比活为925.1U/mg。天然酶和重组酶都受Hg2+的强烈抑制,原始酶受Ag+的抑制不显著而重组酶受到Ag+的完全抑制。它们其它的酶学性质是相似的。重组α-半乳糖苷酶和天然α-半乳糖苷酶都可以有效降解蜜二糖、棉子糖和水苏糖。重组α-半乳糖苷酶的比活性较高,最适温度与最适pH接近动物肠道的生理条件,故重组的α-半乳糖苷酶更有利于作为动物饲料添加剂。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1 α-半乳糖苷酶及其分子生物学的研究进展
• 1.1 α-半乳糖苷酶的来源
• 1.2 α-半乳糖苷酶的生理功能
• 1.3 α-半乳糖苷酶的分类
• 1.4 α-半乳糖苷酶的生化性质
• 1.5 α-半乳糖苷酶的基因工程
• 1.6 α-半乳糖苷酶的表达与调控
• 1.7 α-半乳糖苷酶的结构和功能研究
• 2 α-半乳糖苷酶的应用领域与应用前景
• 2.1 饲料工业
• 2.2 食品工业
• 2.3 造纸工业
• 2.4 医疗领域
• 3 真核生物的表达系统
• 3.1 啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）表达系统
• 3.2 甲醇营养型酵母表达系统
• 3.2.1 多形汉逊酵母表达系统
• 3.2.2 巴斯德毕赤酵母表达系统
• 3.3 巴斯德毕赤酵母表达系统在在饲料添加剂开发上的应用
• 3.3.1 饲料用酶
• 3.3.2 激素
• 3.3.3 抗菌肽
• 研究的目的和意义
• 第二章 一种来源于青霉的新的α-半乳糖苷酶的分离纯化及其酶学性质
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 试剂和仪器
• 1.1.3 培养基和培养条件
• 1.2 酶活性测定
• 1.3 蛋白质浓度和分子量的测定
• 1.4 酶的分离纯化
• 1.4.1 离子交换层析
• 1.4.2 凝胶过滤层析
• 1.5 电泳
• 1.5.1 SDS-PAGE
• 1.5.2 非变性PAGE
• 1.5.3 活性染色
• 1.5.4 非变性梯度凝胶电泳
• 1.6 α-半乳糖苷酶转PVDF膜
• 1.7 纯化蛋白的质谱鉴定与内肽序列的测定
• 1.8 酶学性质
• 1.8.1 α-半乳糖苷酶的最适pH和pH稳定性的测定
• 1.8.2 α-半乳糖苷酶的反应最适温度及热稳定性
• 1.8.3 不同金属离子及相关化学试剂对α-半乳糖苷酶的影响
• m及V_max的测定'>1.8.4 α-半乳糖苷酶反应初速度和K_m及V_max的测定
• 1.8.5 α-半乳糖苷酶比活性测定
• 1.8.6 底物特异性的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 青霉F63α-半乳糖苷酶的活性染色
• 2.2 来源于青霉的α-半乳糖苷酶Agl1的纯化
• 2.3 α-半乳糖苷酶的N端测序
• 2.4 纯化蛋白的内肽序列的测定
• 2.5 α-半乳糖苷酶的酶学性质
• 2.5.1 α-半乳糖苷酶活性的测定
• 2.5.2 α-半乳糖苷酶的酶学性质
• 本章小结
• 第三章 α-半乳糖苷酶基因的克隆
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株和质粒
• 1.1.2 引物合成
• 1.1.3 试剂盒、工具酶和生化试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 青霉F63基因组DNA的提取
• 1.2.2 α-半乳糖苷酶基因组DNA片段的扩增
• 1.2.3 反向PCR
• 1.2.4 α-半乳糖苷酶全长cDNA的获得
• 1.2.5 双酶切
• 1.2.6 DNA电泳回收
• 1.2.7 连接
• 1.2.8 感受态细胞的制备
• 1.2.9 电转化
• 1.2.10 筛选重组子
• 1.2.11 质粒DNA的大量提取
• 1.2.12 α-半乳糖苷酶DNA及cDNA序列测定、序列一致性比较
• 2 结果
• 2.1 获得α-半乳糖苷酶基因的部分序列
• 2.2 反向PCR
• 2.3 α-半乳糖苷酶基因cDNA的克隆及鉴定
• 2.4 青霉F63 α-半乳糖苷酶基因组DNA、cDNA及衍生的氨基酸序列分析
• 2.5 青霉α-半乳糖苷酶起始密码子的推断
• 2.6 青霉F63 α-半乳糖苷酶的序列一致性分析
• 本章小结
• 第四章 α-半乳糖苷酶基因的异源表达
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株与质粒
• 1.1.2 引物合成
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 试剂及仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 α-半乳糖苷酶的重组菌株的构建
• 1.2.2 α-半乳糖苷酶基因信号肽编码序列的去除
• 1.2.3 真核重组表达载体的构建
• 1.2.4 质粒DNA的处理
• 1.2.5 酵母感受态的制备
• 1.2.6 酵母细胞的转化
• 1.2.7 转化子的筛选
• 1.2.8 目的基因在毕赤酵母中的表达检测
• 1.2.9 发酵罐水平重组酵母的高细胞密度发酵
• 2 结果
• 2.1 表达载体的构建和重组质粒的转化
• 2.2 表达α-半乳糖苷酶的阳性重组子的筛选
• 2.3 摇瓶水平α-半乳糖苷酶的表达
• 2.4 重组子的PCR检测
• 2.5 发酵罐水平α-半乳糖苷酶的表达
• 本章小结
• 第五章 重组与天然α-半乳糖酶的酶学性质比较
• 1 材料和方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 实验仪器
• 1.3 重组α-半乳糖酶的纯化
• 1.3.1 粗酶液的制备
• 1.3.2 HiTrap Q Sepharose XL层析
• 1.3.3 Sephacryl S-200分子筛层析
• 1.4 蛋白含量的测定
• 1.5 电泳
• 1.6 表达产物的脱糖基化
• 1.7 α-半乳糖酶的酶学性质的研究
• 2 结果
• 2.1 重组α-半乳糖苷酶的纯化
• 2.2 天然和重组α-半乳糖苷酶的酶学性质比较
• 2.2.1 α-半乳糖苷酶的最适作用pH和pH稳定性
• 2.2.2 α-半乳糖苷酶的最适作用温度和热稳定性
• m值和最大反应速度V_max'>2.2.3 重组α-半乳糖苷酶的K_m值和最大反应速度V_max
• 2.2.4 不同化学试剂对天然和重组α-半乳糖苷酶酶活的影响
• 2.2.5 天然和重组α-半乳糖苷酶的底物特异性
• 2.2.6 重组α-半乳糖苷酶与天然α-半乳糖苷酶的酶学性质的比较
• 本章小结
• 第六章 讨论
• 第七章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介