麝鼠肠炎沙门氏菌PCR诊断方法的建立

论文摘要

肠炎沙门氏菌（Salmonella Eateritidis,SE）属于无宿主特异性而有侵害性的病原菌之一,宿主包括人和各种动物。SE不仅能引起家禽发病死亡造成严重的经济损失,而且被污染的家禽产品作为肠炎沙门氏菌的携带者,还严重危害人类健康。据报道,日、美等发达国家发生的食物中毒事件中40%-80%是由禽沙门氏菌引起的,其中主要病原为肠炎沙门氏菌。目前,国内对麝鼠肠炎沙门氏菌的研究较少,检测方法主要是用分离培养、生化反应和血清学鉴定的方法,检测程序十分繁琐。因此有必要建立快速、敏感、特异的分子生物学诊断方法,以便进行麝鼠肠炎沙门氏菌的早期诊断和预防。本研究根据已报道的肠炎沙门氏菌invA基因序列,利用Oligo6.0和Primer Premier5.0软件设计了一对特异性引物,扩增出长为457bp一条特异性基因片断,并克隆到pGEM-TEasy载体上,经酶切分析、PCR鉴定后,筛选阳性克隆的重组质粒进行核苷酸序列分析及同源性比较。结果表明,测得的麝鼠肠炎沙门氏菌分离株基因序列与GenBank上登录的肠炎沙门氏菌基因序列同源性为98.7%。特异性和敏感性试验结果表明,该诊断方法对麝鼠常见的巴氏杆菌、大肠杆菌、克雷伯氏菌无交叉反应性;测出的肠炎沙门氏菌DNA最低浓度为27.46fg/μL,可用于本病的早期诊断、隐性感染和流行病学调查研究等。利用所建立的PCR诊断方法对50份被检样品进行检测,阳性检出率为58%,而实验室常规分离方法阳性检出率为26%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 1 沙门氏菌的概况
• 2 沙门氏菌感染途径和致病机制
• 3 沙门氏菌检测方法的研究进展
• 4 本课题研究的目的和意义
• 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 试验病料
• 1.2 特异性试验所需材料
• 1.3 标准菌株与载体
• 1.4 试剂
• 1.5 试验用溶液及其配制
• 1.6 主要仪器设备
• 2 方法
• 2.1 肠炎沙门氏菌的分离鉴定
• 2.2 肠炎沙门氏菌标准菌株DNA的制备
• 2.3 引物的设计与合成
• 2.4 PCR反应
• 2.5 PCR产物的纯化回收
• 2.6 感受态细胞的制备
• 2.7 重组连接反应
• 2.8 重组连接后质粒DNA的转化
• 2.9 克隆的筛选
• 2.10 质粒DNA的小量制备--碱裂解法
• 2.11 重组质粒的单酶切鉴定
• 2.12 阳性质粒PCR鉴定
• 2.13 序列分析
• 2.14 最适退火温度筛选
• 2.15 特异性试验
• 2.16 敏感性试验
• 2.17 临床试验
• 结果
• 1 肠炎沙门氏菌的分离鉴定
• 2 PCR扩增
• 3 重组质粒的筛选和鉴定
• 4 序列测定及同源性分析
• 5 退火温度的筛选
• 6 特异性试验
• 7 敏感性试验
• 8 应用试验
• 9 PCR检测结果与实验室分离方法结果的比较
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 附录（攻读学位期间发表论文目录）