论文摘要
帕金森病（Parkinson’s disease PD）是以进行性震颤、运动迟缓、僵直和姿势步态异常为主要表现的神经系统退行性疾病。病理表现为黑质多巴胺能神经元丢失和残存多巴胺神经元胞质中出现特征性嗜酸性包涵体即路易（LEWY）小体。神经生化改变:纹状体内多巴胺及其代谢产物减少。帕金森病早期,一些多巴胺能药物的应用虽然改善了帕金森病患者的运动功能和生活质量,但并不能阻止疾病进程以及药物带来一些副作用。所以积极寻找更为有效防治帕金森病的策略一直是神经科学工作者关注的课题。纹状体多巴胺含量减少为PD病主要神经生化改变。帕金森患者纹状体内多巴胺含量减少,其可能的原因:1黑质多巴胺能神经元减少,致使多巴胺生成减少;2黑质纹状体通路中的纤维发生变性,纤维丢失,突触减少,致使多巴胺无法到达纹状体; 3黑质纹状体通路中突触前膜多巴胺转运蛋白减少致使多巴胺释放重吸收和再利用受限。因此多巴胺能神经元及其黑质纹状体投射纤维、Ⅱ型囊泡单胺转运体（VMAT-2）、多巴胺转运体（DAT）成为多巴胺转运通路中重要组成成分,多巴胺的有效转运依赖于转运通路中神经结构的完整和转运蛋白的正常表达,依赖于黑质纹状体系统的完整性。因此多巴胺能神经元、黑质纹状体投射纤维、Ⅱ型囊泡单胺转运体（VMAT-2）、多巴胺转运体（DAT）是帕金森发病机制中研究的三个方面。重复经颅磁刺激（repetitive transcranial magnetic stimulation rTMS）作为.一种无创、无痛、安全的脑研究手段,已广泛用于运动通路、语言、和认知方面的皮质功能研究。不仅在精神心理疾病,亦在帕金森及运动障碍等疾病方面取得了令人满意的疗效。rTMS是在电磁作用下,在深部脑组织产生感应电流,从而影响或改善脑神经细胞的功能活动。通过调节频率、强度和刺激间歇、刺激持续时间来影响中枢神经系统的兴奋性。研究显示,脑梗死后给大鼠实施rTMS,突触结构改善,促进了神经功能的代偿。经颅磁刺激也被证实通过促进神经轴突再生促进受损周围神经再生和恢复传导功能,对恢复伤后的神经功能的作用优于局部电刺激,因而目前认为rTMS对中枢及外周神经系统损伤性疾病具有良好的治疗作用。临床研究证实PD患者经颅磁刺激治疗后其动作反应时间和运动灵活性均有显著改善,临床症状和临床评分均有明显好转。动物实验表明: rTMS引起大鼠纹状体多巴胺释放增加,对MPTP致大鼠DA系统的损伤有保护作用,黑质内残存的酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）阳性神经元数目增加。细胞研究发现,磁刺激干预对数生长期的PC12细胞,细胞突起增多,细胞外液中多巴胺含量增多。提示TMS有可能成为治疗PD等神经系统疾病的一个理想对策。那么rTMS是否通过保护多巴胺神经元,诱导黑质纹状体纤维再生和上调多巴胺转运蛋白以改善多巴胺转运通路发挥治疗作用值得探讨。基于以上分析,本实验拟利用C57BL小鼠皮下注射MPTP复制帕金森病模型:1评测帕金森病模型鼠运动功能、神经生化及神经病理的改变;2经颅重复磁刺激干预,检测经颅重复磁刺激帕金森病模型鼠运动功能、神经生化及神经病理的改变,以评价其治疗作用;3经颅重复磁刺激干预,检测帕金森病模型鼠纹状体内与神经重塑密切相关突触体素（P38）和神经生长相关蛋白（GAP-43）等活性物质表达的变化;检测帕金森病模型鼠纹状体与多巴胺转运密切相关的多巴胺转运体和囊泡单胺转运体的表达变化。通过以上以探讨rTMS诱导PD鼠多巴胺转运通路可塑性变化,进一步阐明rTMS的治疗机制,为临床应用rTMS治疗帕金森病奠定基础。1 MPTP诱导的C57BL/6J小鼠PD模型的建立与评价目的:观察MPTP对C57BL/6J小鼠运动功能、神经病理及神经生化的影响方法:28只雄性C57BL/6J小鼠随机分为:对照组,MPTP组,每组14只。MPTP组小鼠皮下注射MPTP（15 mg/kg/2h,注射4次）,对照组注射同等剂量的生理盐水。14天后取材。①观察小鼠注射MPTP后行为表现。②利用小数自由活动仪记录注射前及注射后1,3,7,14天记录自由活动次数,评价MPTP对小鼠自由活动能力的影响。③观察MPTP对小鼠身体协调能力的影响。应用ROTARD实验方法记录其注射前及注射后1,3,7,14天于旋转杆停留转数。④利用免疫组织化学染色技术检测黑质酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元及纹状体TH阳性产物的表达变化,并借助图像分析系统对其进行定量分析。⑤利用高效液相-电化学技术检测小鼠纹状体多巴胺（DA）及其代谢产物高香草酸（HVA）及二羟基苯乙酸（DOPAC）含量变化。结果:①注射MPTP后动物短期行为表现:对照组动物在注射生理盐水前后,其行为表现无明显差异,MPTP给药组小鼠都出现不同程度的运动障碍、动作迟缓、震颤、竖毛、甚至尿失禁等。对外界刺激反应迟钝。随着所给MPTP及MPTP用药次数增加,小鼠运动障碍程度增加,动物运动障碍程度增加,症状持续时间延长。一般24小时后症状逐渐消失。②自由活动仪记录结果显示,MPTP注射组与对照组比较,自由活动次数较对照组显著减少（P<0.01）,于注射后1天自由活动次数（78.12±8.04次/5分钟）减少明显,于注射后3天,7,14天自由活动次数呈快速增加趋势。③Rotard结果显示:MPTP注射组与对照组比较,于旋转杆停留的转数较对照组显著减少（P<0.01）,对照组注射前后各时间点无显著变化,MPTP注射组于旋转杆停留的转数在注射后1天（43.1±4 5.54转/次）,3天（60.85±4.35转/次）,7天（68.57±5.41转/次）,14天（73.14±4.73转/次）,随时间延长于旋转杆停留的转数呈增加趋势。④免疫组织化学染色结果显示:对照组黑质内TH免疫阳性神经元沿黑质从脑中轴向外上方向排列,数量较多,胞体较大,呈锥体形或椭圆形,阳性物质为深棕黄色,位于胞浆,着色深。神经元突起明显,阳性纤维细长,量多而密集。MPTP组TH阳性神经元较对照组明显减少,阳性细胞胞体小,阳性产物染色较浅,突起短,阳性纤维少而稀疏。统计学处理:对照组TH阳性神经元（71.88±4.26）明显高于MPTP组（31.67±3.35,p<0.01）;纹状体区TH阳性产物呈棕黄色,对照组纹状体区TH阳性产物呈染色较深,密集。模型组纹状体区TH染色较淡;COD值比较:对照组（0.3037±0.0112）较PD模型组（0.2350±0.1412）有显著差异（p<0.05）。⑤纹状多巴胺（DA）及其代谢产物高香草酸（HVA）及二羟基苯乙酸（DOPAC）结果显示:MPTP小鼠纹状体DA含量（151.26±38.46nmol/L）与对照组组（515.44±90.01 nmol/L）相比显著降低（P<0.01）,大约减少70.3%;MPTP小鼠纹状体HVA含量（593.34±36.45L nmol/L）与对照组（809.91±121.88 nmol/L）相比显著降低（P<0.01）,大约减少26.8 %; MPTP小鼠纹状体DOPAC含量（409.03±275.6 nmol/L）与对照组（1180.11±641.25 nmol/L）相比显著降低（P<0.01）大约减少67.3%。结论:MPTP诱导的PD小鼠模型具有人类PD的绝大多数症状,如自主活动减少,动作迟缓,静止性震颤、运动减少、肢体僵硬等。病理学检查发现黑质TH免疫反应阳性多巴胺能神经元明显减少,与PD病人病理改变相似。此外黑质区神经元尼氏小体显著减少或消失。纹状体区TH免疫反应阳性纤维显著减少。神经生化显示DA及其代谢产物较对照组减少严重。通过上述多个方面的评估,小鼠皮下注射MPTP（15 mg/kg/2h,注射4次）较完全地达到PD模型标准。2重复经颅磁刺激对帕金森模型鼠疗效观察目的:探讨重复经颅磁刺激（repetitive transcranial magnetic rTMS）对帕金森病（Parkinson’s disease PD）模型鼠运动功能,神经病理学及神经生化的影响,观察rTMS对PD模型鼠的疗效。方法: 42只雄性C57BL/6J小鼠随机分为: PD模型组,假磁刺激组,rTMS组,每组14只。小鼠皮下注射MPTP（15 mg/kg/2h,注射4次）复制帕金森病模型,24小时后重复经颅磁刺激干预（刺激频率为1Hz,刺激强度1T,每次刺激25秒,刺激5个序列,每天刺激一次,共14天）,14天后取材。①观察小鼠注射MPTP后行为表现;②利用小数自由活动仪记录注射前及注射后1,3,7,14天记录自由活动次数,评价MPTP对小鼠自由活动能力的影响。③利用ROTARD实验方法记录其注射前及注射后1,3,7,14天于旋转杆停留转数,观察rTMS对小鼠身体协调能力的影响;④利用免疫组织化学染色技术检测黑质酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元及纹状体TH阳性产物rTMS后的表达变化,并借助图像分析系统对其进行定量分析。⑤利用尼氏染色观察rTMS对黑质多巴胺神经元尼氏小体的表达的影响。⑥利用高效液相-电化学技术检测rTMS对PD小鼠纹状多巴胺（DA）及其代谢产物高香草酸（HVA）及二羟基苯乙酸（DOPAC）含量的影响。结果:①注射MPTP后动物短期行为表现:对照组动物在注射生理盐水前后,其行为表现无明显差异,MPTP给药组小鼠都出现不同程度的运动障碍,动作迟缓,震颤,竖毛,甚至尿失禁等。②自由活动结果显示:rTMS组与PD模型组及假磁刺激组相比,自由活动次数于各组无显著差异（P>0.05）,但均见注射MPTP后自由活动能力迅速下降,随后又出现快速上升趋势。③Rotard结果显示:rTMS组于旋转杆停留的转数明显高于PD模型组及假磁刺激组（P<0.01）;PD模型组及假磁刺激组无显著差异（P>0.05）;各实验组注射MPTP后,随时间延长于旋转杆停留的转数均显著增加,rTMS组转数增加显著。④免疫组织化学染色结果显示:rTMS组黑质区TH免疫反应阳性神经元（36.67±3.82）显著多于PD组（31.67±3.35,P<0.05）和假磁刺激组（32.45±3.31,P<0.05）;rTMS组纹状体区TH阳性纤维数量PD组、假磁刺激组明显增多,校正光密度值（COD值）（0.2779±0.01429）显著多PD组（0.2467±0.01366,P<0.05）及假刺激组（0.2433±0.0301,P<0.05）。⑤尼氏染色结果显示:rTMS组多巴胺神经元中布满着深蓝色呈颗粒状的尼氏体,PD组、假刺激组多巴胺神经元内尼氏体大量脱失,尚存的尼氏体着色浅淡,⑥纹状多巴胺（DA）及其代谢产物高香草酸（HVA）及二羟基苯乙酸（DOPAC）结果显示:PD组及srTMS组纹状体DA含量（151.26±38.46 nmol/L,185.98±40.7nmol/L）与rTMS组（258.21±50.35 nmol/L）相比显著降低（P<0.01）,大约减少41.5%和30%; PD组及srTMS组小鼠纹状体HVA含量（593.34±36.45nmol/L, 622.69±50.95nmol/L）与rTMS组（711.89±54.02 nmol/L）相比显著降低（P<0.01）,大约减少15.2%和12.5%; PD组及srTMS组小鼠纹状体DOPAC含量（409.03±275.6nmol/L, 386.84±192.95nmol/L）与rTMS组（936.8±373.61 nmol/L）相比显著降低（P<0.05）大约减少56.3%和58.7%。PD组及srTMS组纹状体DA,HVA,DOPAC含量无显著差异（P>0.05）。结论:rTMS可有效改善PD小鼠的运动协调能力,保护受损的黑质区TH阳性神经元及纹状体区TH阳性纤维,提高纹状体多巴胺及其代谢产物的含量。3复经颅磁刺激对帕金森鼠治疗机制的探讨目的:探讨重复经颅磁刺激（repetitive transcranial magnetic rTMS）对帕金森病（Parkinson’s disease PD）模型鼠纹状体生长相关蛋白（Growth activty protein-43 GAP-43）、突触素（synaptophysin P38）、Ⅱ型单胺囊泡转运体（vesicular monoamine transporter-2 VMAT-2）、多巴胺转运体（Dopamine transporter DAT）表达的影响,进一步探讨rTMS治疗机制。方法:56只雄性C57BL/6J小鼠随机分为:对照组,PD模型组,假磁刺激组,rTMS组,每组14只。小鼠皮下注射MPTP（15 mg/kg/2h,注射4次）复制帕金森病模型,重复经颅磁刺激干预（刺激频率为1Hz,刺激强度1T,每次刺激25秒,刺激5个序列,每天刺激一次,共14天）,利用免疫组织化学染色技术和Western-bolt检测GAP-43和P38的表达变化,利用免疫组织化学染色技术检测VMAT-2和DAT的表达变化。借助图像分析系统对所有指标进行定量分析。结果:免疫组织化学染色结果显示:①PD组、srTMS组及rTMS组GAP-43阳性产物较对照组明显增多,以rTMS组GAP-43表达升高最为明显,且着色深,PD组（0.2519±0.0101）和srTMS组（0.2514±0.0157）校正光密度值（COD）均明显高于对照组（0.2350±0.0141,P<0.05）,rTMS组COD显著高于对照组（0.2679±0.0163, P<0.01）及PD组和srTMS组（P<0.05）。Western blot检测结果显示,rTMS组GAP-43蛋白表达较PD组和srTMS组明显增强（P<0.05）且显著高于对照组（P<0.05）。②PD组和srTMS组及rTMS组纹状体P38表达较对照组反应产物明显减少,但rTMS组P38表达较PD组和srTMS组增多。rTMS组COD值（0.1698±0.0258）明显低于对照组（0.1751±0.019,P<0.05）,但显著高于PD组（0.1652±0.0136）和srTMS组（0.1652±0.0468） （P<0.05）。Western blot检测结果显示,rTMS组P38蛋白表达较对照组明显减少（P<0.05）,但显著高于PD组和srTMS组（P<0.05）。③rTMS组纹状体VMAT-2和DAT表达较对照组均明显减少,但显著高于PD组（0.2494±0.0108）和假刺激组（0.2492±0.01021）;其免疫反应产物校正光密度值（COD）显著低于对照组（P<0.05）,但显著高于PD组和srTMS组（P<0.05）。④rTMS组纹状体DAT表达较对照组均明显减少,但显著高于PD组和假刺激组;其免疫反应产物校正光密度值（COD）显著低于对照组（P<0.05）,但显著高于PD组和srTMS组（P<0.05）。结论:rTMS可诱导受损的纹状体区GAP-43、P38、VMAT-2和DAT的表达上调,推测rTMS一方面可促进帕金森病鼠黑质-纹状体多巴胺转运通路中纤维再生和突触重塑,另一方面通过促进多巴胺神经元末梢VMAT-2和DAT蛋白的表达,可促进多巴胺释放及提高多巴胺利用率达到治疗效果。4结语本研究:成功复制MPTP诱导的PD模型并证实了rTMS对帕金森病的疗效。同时证实了rTMS可诱导帕金森病鼠纹状体区GAP-43和P38的表达上调,推测rTMS可有促进多巴胺转运通路中纤维再生和突触重塑的作用,另一方面rTMS可促进多巴胺神经元末梢VMAT-2和DAT蛋白的表达,推测rTMS可通过VMAT-2和DAT蛋白的表达上调,促进多巴胺释放及提高多巴胺利用率,达到治疗效果。为今后临床应用rTMS治疗帕金森病奠定理论基础。
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