论文摘要
淀粉样蛋白（β-amyloid, Aβ）沉淀是阿尔茨海默症（Alzheimer disease,AD）的重要病理特征之一。Aβ是由淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein ,APP）经β-分泌酶（β-site APP-cleaving enzyme ,BACE）和γ-分泌酶水解产生的。BACE被认为是Aβ形成的关键酶,近年来已经成为阿尔茨海默症研究及治疗的热点之一。但是人们对其在细胞内具体的转运过程,生理活性的调节机制以及正常生理功能还缺乏全面的了解。为了进一步研究BACE1的生理功能及其作用机制,我们以BACE1胞内段构建诱饵蛋白,用酵母双杂交方法筛选与之相互作用的蛋白。我们用BACE1-C473-501作为诱饵蛋白筛选人胎脑文库后,得到62个阳性克隆。经测序和序列比对后,我们得到了三个蛋白:分别为CUTA（cutA divalent cation tolerance,CUTA）、VPS25（vacuolar protein sorting 25）和CKB（brain-type creatine kinase）。β-半乳糖苷酶活性测定说明这三个蛋白在酵母AH109中可以与BACE1发生相互作用。我们构建了可以在哺乳动物细胞中表达这三个蛋白的载体。免疫共沉淀实验证明外源性的CUTA和BACE1蛋白能够在HEK293T细胞中发生相互作用,而且CUTA能够与内源性的BACE1进行特异性结合。但是,利用相同的试验方法无法检测到VPS25、CKB与BACE1的相互作用。进一步的研究表明,在N2a/APP695细胞中CUTA的过度表达虽然不会引起BACE1蛋白水平的变化,但能增加APP蛋白水平。我们的研究发现了一个新的与BACE1相互作用蛋白CUTA。在HEK293T细胞和N2a细胞中进行的实验证明CUTA和BACE1能够发生相互作用,并且CUTA的过度表达能够上调APP蛋白水平。这些研究说明CUTA可能参与了BACE1酶活性的调节,或者提高了APP蛋白的表达。对于CUTA的进一步研究,不仅有助于揭示CUTA在哺乳动物中的生物学功能,还有可能为BACE1生理功能的调节机制研究和AD的治疗开辟一条新的途径。
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标签：酵母双杂交论文;