Scytovirin在大肠杆菌中的表达

论文摘要

Scytovirin（SVN）是2002年由H．R．Bokesch等人从Cyanobacterium Scytonema varium（伪枝蓝细菌属的蓝细菌）发酵液中分离纯化得到一种新的抗HIV的蛋白，并发现其具有抗HIV-1活性，它的EC50在0.3-22 nmol／L之间。根据NCBI上公布的SVN基因编码序列合成基因，设计并合成引物，用PCR法克隆出SVN基因片段，然后将SVN基因分别克隆至不同的表达载体中进行表达。首先构建了与TrxA融合的pET32c-SVN载体，转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，并在摇瓶里诱导SVN表达，经鉴定SVN是在细胞内可溶性的表达，经阴离子Q柱和金属螯合HIS柱纯化后，用SVN蛋白免疫日本大耳白兔，制备出多克隆抗体，并利用免疫印迹法鉴定构建的分泌表达载体是否表达。我们还构建了三种带有不同信号肽MalE、OmpA和PhoA的分泌表达载体pMAL-SVN、pBR-OmpA和pPAS，分别转化相应的宿主菌株TB1、BL21（DE3）、YK537。另外，将含有pPAS质粒的工程菌，在5L发酵罐中培养。结果表明我们成功的构建了SVN的胞内和分泌表达载体，初步完成了小分子蛋白在大肠杆菌中分泌表达平台的搭建。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 第一章 前言
• 1.1 AIDS现状
• 1.2 AIDS治疗药物研究
• 1.3 SVN
• 1.4 在大肠杆菌中外源蛋白的表达
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 质粒
• 2.1.3 基因、引物设计与合成
• 2.1.3.1 SVN基因合成
• 2.1.3.2 引物合成
• 2.1.4 限制性内切酶及工具酶
• 2.1.5 试剂盒
• 2.1.6 核酸及蛋白分子量标准
• 2.1.7 抗体
• 2.1.8 主要仪器
• 2.1.9 主要试剂
• 2.1.10 主要培养基
• 2.1.11 主要溶液
• 2.2 方法
• 2.2.1 SVN与TrxA融合表达、纯化、活性测定及多克隆制备
• 2.2.1.1 SVN与TrxA融合表达载体的构建
• 2.2.1.2 SVN与TrxA融合在摇瓶内诱导表达目的蛋白
• 2.2.1.3 SVN与TrxA融合蛋白的纯化
• 2.2.1.4 多克隆抗体的制备
• 2.2.1.5 活性测定
• 2.2.2 SVN的分泌表达载体构建
• 2.2.2.1 构建与MalE信号肽融合分泌的表达载体
• 2.2.2.2 构建与OmpA信号肽融合分泌的表达载体
• 2.2.2.3 构建与PhoA信号肽融合分泌的表达载体
• 2.2.3 SVN的分泌表达检测
• 2.2.4 YK537/pPAS工程菌在发酵罐上的研究
• 2.2.4.1 发酵罐培养
• 2.2.4.2 无机磷的含量测定
• 2.2.4.3 确定分泌表达量
• 2.2.5 活性测定
• 第三章 结果
• 3.1 SVN与TrxA融合表达、纯化、活性测定及多克隆制备
• 3.1.1 SVN与TrxA融合表达载体的构建
• 3.1.2 SVN与TrxA融合表达
• 3.1.3 SVN与TrxA融合蛋白的纯化
• 3.1.4 多克隆抗体的制备
• 3.1.5 活性测定
• 3.2 SVN的分泌表达载体构建
• 3.2.1 构建与MalE信号肽融合分泌的表达载体
• 3.2.2 构建与OmpA信号肽融合分泌的表达载体
• 3.2.3 构建与PhoA信号肽融合分泌的表达载体
• 3.2.4 SVN的分泌表达检测
• 3.2.5 YK537/pPAS工程菌在发酵罐上的研究
• 第四章 结论
• 参考文献
• 发表文章
• 附录
• 致谢