论文摘要
目的1观察选择性地抑制核因子-κB活性对白血病K562细胞凋亡的影响；2观察蛋白酶体抑制剂MG132对核因子-κB活性及凋亡抑制蛋白Survivin表达的影响；3探讨核因子-κB活性和凋亡抑制蛋白Survivin表达的相互关系；4探讨NF-κB信号转导通路的调节对白血病细胞凋亡的可能机制。方法细胞系为人髓系白血病细胞系K562，首先进行细胞传代培养。取处于指数生长期的细胞进行实验，实验分5组，空白对照组不加MG132，实验组细胞培养液中加入不同浓度的MG132（终浓度分别为2、4、6、8μmol／L），继续培养24 h进行实验检测。采用细胞形态学观察和流式细胞术检测K562细胞凋亡，免疫细胞化学染色检测NF-κB p65活性和Survivin蛋白的表达，Western印迹定量分析NF-κB活性和Survivin的表达，采用统计学方法分析实验数据。实验设复孔3个，实验重复3次。结果1不同浓度的MG132作用于细胞24 h后可观察到K562细胞发生凋亡，光镜下可观察到K562细胞染色质固缩、胞核碎裂及凋亡小体等典型的凋亡形态。流式细胞仪检测并分析MG132对K562细胞的致凋亡作用，发现其细胞凋亡率随着MG132浓度的升高而逐渐上升，实验组细胞凋亡率分别为11.2％±2.5％、17.2％±2.3％、21.7％±1.8％和24.3％±3.4％，与对照组比较均有明显差异（P＜0.01），表现出剂量依赖效应。2 NF-κB p65和Survivin蛋白在K562细胞内的表达：免疫细胞化学检测显示NF-κB p65和Survivin蛋白在K562细胞内的异常高表达，NF-κB p65表达阳性产物呈棕褐色颗粒，位于细胞浆／细胞核，Survivin表达位于细胞浆，亦呈棕褐色颗粒。两者在MG132作用于细胞24h后其表达水平均明显下降。3 Western印迹定量分析NF-κB p65和Survivin蛋白表达量的变化及其相互关系：Western印迹检测显示，MG132作用于K562细胞24h后，NF-κB p65和Survivin蛋白的表达都明显下调。而且，随着MG132浓度的增加其表达呈逐渐下降的趋势，NF-κB p65蛋白表达分别下调至作用前的75.0％±3.7％、59.9％±5.3％、45.4％±5.7％和25.0％±4.2％，而Survivin蛋白表达分别下调至作用前的90.9％±10.1％、66.7％±5.2％、45.4％±5.7％和30.3％±6.6％，提示NF-κB p65活性降低的同时Survivin蛋白的表达也下调，两者呈正相关（Pearson相关系数t=0.989，P＜0.01）。结论1 MG132可以有效地抑制NF-κB的活性，诱导K562细胞发生凋亡，表现出剂量依赖效应：2 NF-κB的活性下调的同时抗凋亡蛋白Survivin的表达也随之下调，Survivin蛋白的表达和NF-κB活性密切正相关；3 MG132能有效地选择性地抑制NF-κB的活性，其对Survivin蛋白等多种抗凋亡因子表达的影响可能是通过干扰基因的转录来实现的。