基于阳离子聚合物/DNA纳米复合物微针给药系统的研究

论文摘要

DNA疫苗是将含有编码抗原基因的真核表达质粒直接接种体内,在体内表达相应抗原,以刺激机体产生针对该抗原的免疫应答,产生保护性免疫。它是在基因治疗和转基因技术基础上产生的第三代疫苗,是疫苗的一次革命。但目前DNA疫苗的给药系统比较单一,主要是质粒DNA冻干粉针,肌注给药后,DNA进入组织细胞,特别是到达树状突细胞（DCs）等抗原提呈细胞（antigen-presenting cells,APCs）的转运效率较低,因而导致抗原表达水平低,免疫效果不好。目前关键是在于缺乏高效低毒的DNA疫苗的传递系统。皮肤特别是在活性表皮层中存在着大量的树状突细胞（DCs）—郎格汉氏细胞(Langerhans cells,500-1000 cells mm-2),这是一种高效的抗原提呈细胞（APCs）,可产生很强的免疫效应,因此活性表皮层被看作疫苗接种的最佳部位。然而DNA疫苗这样的亲水性大分子药物是无法穿透皮肤角质层的屏障,并且皮肤内的酶系会对DNA疫苗产生降解作用,而使抗原提呈细胞无法捕获DNA疫苗。为此我们设计了阳离子聚合物/DNA疫苗复合物微针给药系统。微针（Microneedles）是指通过微电子机械工艺技术（MEMS）制作的,尺寸在微米级,长度100μm以上呈针状的复杂结构,材料可以为硅、聚合物、金属等。微针在生物医学领域有广泛的应用。微针用于药物传输系统具有精确、无痛、高效、便利的优势。利用微针给药系统可主动靶向于皮肤特定深度,即活性表皮层的郎格汉氏细胞。为了提高DNA疫苗在体内的稳定性,合成了基于聚乙烯亚胺（PEI）的基因载体,选用两亲性的嵌段共聚物Pluronic（聚氧乙烯-聚环氧丙烷-聚氧乙烯嵌端共聚物）和Solutol（聚乙二醇-12羟基硬脂酸酯）修饰支链高分子量PEI,不但可以增加PEI/DNA复合物的稳定性,屏蔽复合物表面的正电荷,减小其对细胞的毒性作用,还因为Pluronic和Solutol分子中含有疏水基团,对细胞具有一定的亲和力,不会显著降低DNA疫苗体内外转染效率。以乙肝DNA疫苗为模型药物,考察了阳离子聚合物/DNA疫苗复合物微针透皮给药后的小鼠体内免疫效果。第一部分使用琥珀酰亚胺酯法活化非离子表面活性剂Pluronic或Solutol的末端羟基,得到活化率高,反应活度大的产物。使用活化后的聚合物按不同比例对PEI进行修饰。经过葡聚糖凝胶纯化,超滤脱盐,冷冻干燥,成功的合成了一系列不同修饰度（每个PEI分子上分别接枝1个、2个、5个、10个和20个Pluronic或Solutol）的Graft-PEI聚合物。1H-NMR结果显示,本方法合成的阳离子聚合物接枝率高,控制投药量能定量地对PEI进行修饰,其接枝率与反应时投药量的摩尔比呈良好的线性关系,说明该合成方法比较稳定、可靠,产率高,具有良好的可控性。1H-NMR图谱中未见其它杂质峰,证明这些阳离子聚合物的纯度较高。第二部分重点考察了阳离子接枝聚合物/DNA复合物的相关性质。凝胶电泳阻滞分析结果显示,完全阻滞DNA所需的N/P值随着PEI修饰度的增加而增大,随着修饰物分子量的减小而减小。本实验所制备的PEI/DNA、graft-PEI/DNA复合物粒径在60-400 nm范围内。随着复合物N/P值的增加,粒径有减小的趋势。高分子量的修饰物,在高修饰度时复合物的粒径明显增大。复合物的zeta电位随N/P值的增加而增加;相同N/P值的复合物,其zeta电位随表面活性剂接枝数的增加而减少;复合物的zeta电位在相同修饰度且相同N/P值时,随表面活性剂分子量的减小而略有增加。MTT法测定细胞毒性的结果表明,使用表面活性剂修饰PEI可以不同程度地降低其细胞毒性,在低浓度时每个PEI接枝一个表面活性剂的分子即可显著降低细胞毒性。在高浓度时每个PEI接枝≥5个表面活性剂分子则可显著降低细胞毒性。第三部分评价了阳离子接枝聚合物/DNA复合物体内外转染效果。选用了两种分别编码绿色荧光蛋白和虫荧光素酶的质粒。为了获得虫荧光素酶在体内较高的表达,将CMV启动子克隆到虫荧光素酶表达质粒pGL3-basic Luciferase Reporter vector中,构建成重组的pGL3-CMV Luciferase Reporter vector。阳离子接枝聚合物/DNA复合物在Hela细胞上的转染效果表明,低分子量的L61和Solutol修饰的PEI在低修饰度时不会显著地降低转染效果,低P123修饰度的PEI的最佳转染效果与未修饰的PEI相似。随着表面活性剂分子量增大,接枝率增加,其最佳转染效率随之下降。ICR小鼠尾静脉注射复合物,测定各个脏器中虫荧光素酶的表达,除了肺部外,低修饰度的PEI最佳转染效率显著优于未修饰的PEI。第四部分使用微电机技术制备了SU-8聚合物微针,考察了微针的机械强度,结果表明该微针阵列可以容易地穿破铝箔和离体皮肤,并具有一定的坚韧度,不易折断。考察了微针对不同药物的体外透皮促进作用。首先考察了四种不同油水分配系数的小分子药物（吲哚美辛、酮洛芬、美索巴莫、更昔洛韦）,结果表明吲哚美辛的皮肤渗透速率增加4.05倍,酮洛芬的皮肤渗透速率增加4.77倍,美索巴莫的皮肤渗透速率增加6.06倍,更昔洛韦的皮肤渗透速率增加12.49倍,说明logP值是影响药物经微针透皮传递速率的重要因素,微针对于水溶性药物的透皮促进作用较脂溶性药物更加有利。又考察了四种不同分子量的生物大分子药物（胰岛素、溶菌酶、卵清白蛋白、人血清白蛋白）,结果表明与无法透过完整的皮肤相比,生物大分子药物可以透过微针阵列处理过的皮肤,经皮渗透速率可以达到小分子药物的水平。生物大分子药物分子量与经皮渗透速率成反比。第五部分主要考察了DNA疫苗的体内免疫效果。通过细胞吞噬实验证明了修饰后的PEI其细胞吞噬过程未发生改变。抗DNAaseⅠ的保护实验表明复合物可以有效地保护DNA不被降解。微针阵列可刺入小鼠活体皮肤,并在皮肤表皮层产生几十微米的孔洞,提供了复合物穿透角质层的通道。以乙肝疫苗为模型药物,考察体内免疫效果,分别测定血清中的抗体滴度,脾细胞分泌的细胞因子（γ-INF,IL-4）,及脾细胞的增殖。与乙肝DNA疫苗复合物肌注和DNA疫苗水溶液肌注相比,阳离子聚合物/DNA疫苗复合物微针经皮给药在第4周后可以显著提高血清中的抗体滴度,同时显著提高了细胞免疫水平,刺激机体产生了很强的免疫应答。第六部分主要考察了阳离子聚合物/DNA疫苗复合物微针给药系统的组织刺激性。DNA疫苗复合物微针或肌注给药后都表现出了一定的组织刺激反应,微针给药组的炎症反应明显低于肌注给药组,说明阳离子聚合物/DNA疫苗复合物微针给药系统具有较好的生理适应性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 聚乙烯亚胺的修饰及表征
• 一、材料与仪器
• （一） 材料
• （二） 仪器
• 二、实验方法和结果
• （一） 溶剂的无水化处理
• （二） 普朗尼克和聚乙二醇硬脂酸酯的活化
• （三） 聚乙烯亚胺的修饰
• （四） 接枝聚合物的分子量以及修饰度的测定
• 三、讨论
• 四、小结
• 第二部分 Graft-PEI/DNA复合物的制备及性质考察
• 一、材料与仪器
• （一） 材料
• （二） 仪器
• 二、实验方法和结果
• （一） 复合物的制备
• （二） 凝胶电泳阻滞分析
• （三） 复合物粒径和zeta电位测定
• （四） graft-PEI细胞毒性测定
• 三、讨论
• 四、小结
• 第三部分 Graft-PEI/DNA复合物的体内外转染效果评价
• 一、材料与仪器
• （一） 材料
• （二） 仪器
• 二、实验方法和结果
• （一） pGL3-CMV Luciferase Reporter vector重组质粒的构建
• （二） 感受态细菌的制备及重组质粒的转化
• （三） 质粒DNA的抽提和纯化
• （四） 体外细胞转染实验
• （五） 动物体内表达实验
• 三、讨论
• 四、小结
• 第四部分 微针的制作及其对药物经皮促透作用的研究
• 一、材料与仪器
• （一） 材料
• （二） 仪器
• 二、实验方法和结果
• （一） 微针阵列的制备和评价
• （二） 微针阵列对小分子药物的经皮促透作用
• （三） 微针阵列对大分子药物的经皮促透作用
• （四） 微针阵列对质粒DNA的经皮促透作用
• 三、讨论
• 四、小结
• 第五部分 阳离子聚合物/DNA疫苗复合物微针给药系统体内免疫效果评价
• 一、材料与仪器
• （一） 材料
• （二） 仪器
• 二、实验方法和结果
• （一） 复合物体外细胞吞噬实验
• （二） 复合物抗DNAase Ⅰ的保护作用
• （三） 小鼠活体皮肤微针阵列刺入实验
• （四） 乙肝DNA疫苗小鼠体内免疫效果研究
• 三、讨论
• 四、小结
• 第六部分 阳离子聚合物/DNA疫苗复合物微针给药系统组织刺激性研究
• 一、材料与仪器
• （一） 材料
• （二） 仪器
• 二、实验方法和结果
• （一） 微针阵列对皮肤刺激性实验
• （二） 阳离子聚合物/DNA疫苗复合物组织刺激性研究
• 三、讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 文献综述
• 致谢