γ-分泌酶抑制剂对人卵巢癌细胞生物学行为的影响及其机制的研究

论文摘要

卵巢癌是发生于卵巢组织的恶性肿瘤,占所有妇科恶性肿瘤的15%左右,仅次于宫颈癌,而其死亡率却位居第一位。卵巢癌有起病隐匿、早期不易发现、易转移、预后差等特点,所以卵巢癌患者5年生存率较低,成为严重威胁妇科肿瘤患者生命的恶性疾病。因此探讨卵巢癌的发生机制、寻找新的研究靶点、为肿瘤基因治疗提供新思路无疑具有十分重要的意义。Notch信号途径作为一种古老而保守的信号通路,其通过影响细胞凋亡、增殖、分化等多效性作用的信号途径调节多细胞动物的形态发育和形成。目前研究证实其不但在组织的发生发展过程中有重要作用,且与肿瘤的发生发展有着密切关系,在人类许多实体瘤（如宫颈癌、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、胸膜间皮瘤和涎腺肿瘤）及血液系统肿瘤中有异常表达。有研究表明活化的Notch1及其下游基因HES1在卵巢腺癌中的表达明显高于在卵巢腺瘤及正常卵巢组织中的表达,表明Notch1与卵巢癌的发生有关。γ-分泌酶是一包括PS二聚体、Nicastrin、PEN-2等组分的多酶复合体。γ-分泌酶剪切APP、Notch、E-cadherin、ErbB-4受体酪氨酸激酶等膜蛋白,研究表明γ-分泌酶抑制剂对多种细胞的生长具有抑制作用。本实验应用实时RT-PCR技术检测Notch1在不同卵巢癌细胞系中的表达,筛选出Notch1相对表达量较高的卵巢癌细胞株,应用γ分泌酶抑制剂阻断Notch信号通路,观察抑制Notch1表达对人卵巢癌细胞生物学行为的影响,探讨Notch1在卵巢癌细胞生长增殖、黏附及侵袭转移中的作用,为卵巢癌的治疗提供一种新思路。【研究目的】1.筛选高表达Notch1基因的人卵巢癌细胞株。2.初步研究γ-分泌酶抑制剂对人卵巢癌细胞的生长、增殖、黏附、侵袭及迁移活性的影响,以及其对细胞周期分布的影响,并探讨其作用机制。【方法及结果】本研究分为二部分。第一部分:γ-分泌酶抑制剂对人卵巢癌细胞生长及增殖的影响方法:1.采用实时PCR技术筛选高表达Notch1基因的人卵巢癌细胞株。2. MTT试验及细胞集克隆试验检测细胞生长及增殖情况。3.流式细胞仪检测细胞周期分布。结果:1.在A2780细胞中Notch1的相对表达量最高,为45.68。2.γ-分泌酶抑制剂能抑制A2780细胞生长,并呈时间和剂量依赖性。3.γ-分泌酶抑制剂能抑制A2780细胞的增殖,使细胞克隆形成率下降（p<0.001）。4.γ-分泌酶抑制剂使A2780细胞的G1期延长,细胞大部分停滞于此期,具有时间依赖性（p<0.001）。第二部分:γ-分泌酶抑制剂对人卵巢癌细胞黏附、侵袭及迁移活性的影响方法:1.用γ-分泌酶抑制剂（DAPT）阻断Notch信号,实时RT-PCR检测Notch1及HES1在基因水平的表达情况2.Western blot试验检测Notch1及HES1在蛋白水平的表达情况。3. MTT法检测细胞黏附能力的改变。4. Transwell实验观察细胞侵袭转移情况。5.细胞免疫荧光试验检测HES1在人卵巢癌细胞中的定位及表达情况。结果:1.DAPT作用后,Notch1及HES1在基因及蛋白水平的表达均被抑制,表达量下降呈时间依赖性,差异有统计学意义（p<0.001）。2. DAPT作用后,A2780细胞的黏附、侵袭及转移活性下降,呈时间依赖性（p<0.05）。3. HES1在人卵巢癌细胞中主要以核表达为主,也有少量的胞浆表达;DAPT作用后,HES1在人卵巢癌细胞中的表达下降,且主要集中于核表达,表达下降情况呈时间依赖性。【结论】1.γ-分泌酶抑制剂能够抑制A2780细胞的生长及增殖。2. Notch信号通路被抑制后,Notch1的表达下降,A2780细胞的细胞周期主要停滞于G1期,提示Notch1在卵巢癌细胞周期调节中有重要作用。3.抑制Notch1基因的表达能够抑制卵巢癌A2780细胞的黏附、侵袭及转移活性,说明Notch1在人卵巢癌细胞的黏附、侵袭及转移过程中发挥重要作用,且其机制可能与HES1的下调有关。4.γ-分泌酶抑制剂能够改变HES1在人卵巢癌细胞中的表达及定位,并对其表达有抑制作用。5.Notch信号通路可作为卵巢癌治疗的有效靶点,γ分泌酶抑制剂可能成为卵巢癌治疗的一种新药。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 文献回顾
• 第一部分 γ-分泌酶抑制剂对人卵巢癌细胞生长及增殖的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 第二部分 γ-分泌酶抑制剂对人卵巢癌细胞黏附、侵袭及迁移活性的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 致谢