牛传染性鼻气管炎病毒gG缺失株构建及gG单克隆抗体制备

论文摘要

牛传染性鼻气管炎（Infectious Bovine Rhinotracheitis,IBR）,是由牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious Bovine Rrhinotracheitis viruses,IBRV）引起的一种牛的以上呼吸道炎症为主的急性、热性、接触性传染病,临床表现多种多样,以鼻气管炎、眼结膜炎、高热、流产、传染性脓疱为主要特征。该病在世界范围内流行,并且每年都给养牛业造成巨大的经济损失,鉴于传统疫苗存在的弊端及该病毒的特点,近年来对活病毒疫苗的研究受到了更大的关注。本研究构建了一株牛传染性鼻气管炎病毒gG基因缺失的重组病毒,为研究活病毒疫苗及构建表达外源基因的IBRV重组病毒活载体疫苗奠定基础。同时制备了牛传染性鼻气管炎病毒gG蛋白单克隆抗体,为建立能鉴别缺失病毒与野生病毒的分子鉴别诊断方法提供了材料。论文主要结果简述如下:1.牛传染性鼻气管炎病毒gG基因缺失突变株的构建本实验根据牛传染性鼻气管炎病毒全基因组序列（基因登陆号为AJ004801）设计引物,用PCR分别扩增gG基因上游和下游约1.0 kb和0.8kb的片段作为同源重组臂,用相应的限制性内切酶将其依次定向克隆于载体pcDNA3.1（+）myc-His B中,然后插入EGFP报告基因,构建成重组转移质粒,并命名为pcDNA3.1-ZYP。以脂质体转染法将经线性化的pcDNA3.1-ZYP、质粒pBICP0与IBRV基因组DNA在牛肾细胞（MDBK）上共转染,成功的进行了同源重组,有待进行IBRV gG-/EGFP+突变株的筛选和纯化。2.抗牛传染性鼻气管炎病毒gG蛋白单克隆抗体的制备用纯化的IBRV为免疫原,免疫Balb/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA方法筛选和有限稀释法三次克隆获得一株分泌抗IBRV单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞,命名为E12。免疫荧光试验证明此单抗能特异性地与IBRV反应,用小鼠腹水生产的McAb的ELISA效价为1:3200。此单克隆抗体可以用于IBRV的检测,同时为我国牛传染性鼻气管炎根除计划提供工具。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表（ABBREVIATION）
• 第1章 文献综述
• 引言
• 1.1 IBR的发展简史及分类地位
• 1.2 IBR的流行病学
• 1.3 IBRV的基本生物学特征
• 1.4 IBR的分子生物学特征
• 1.5 IBR的临床症状
• 1.6 诊断
• 1.7 预防和控制
• 1.7.1 常规疫苗
• 1.7.2 DNA疫苗
• 1.7.3 亚单位疫苗
• 1.7.4 基因工程缺失苗
• 1.7.5 病毒活载体重组疫苗
• 第2章 牛传染性鼻气管炎病毒gG基因缺失株的构建
• 2.1 研究目的与意义
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 试验材料
• 2.2.2 试验方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 病毒PFU的测定
• 2.3.2 EGFP表达盒及gG基因上下游同源臂的PCR扩增结果
• 2.3.3 重组转移质粒的鉴定结果
• 2.3.4 重组转移质粒伴DNA3.1-ZYP浓度的测定
• 2.3.5 同源重组结果
• 第3章 抗牛传染性鼻气管炎病毒gG蛋白单克隆抗体的制备
• 3.1 研究目的意义
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 试验材料
• 3.2.2 试验方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 细胞融合
• 3.3.2 杂交瘤细胞的筛选
• 3.3.3 小鼠腹水单克隆抗体效价的测定
• 3.3.4 单抗亚类鉴定结果
• 3.3.5 间接免疫荧光试验
• 第4章 讨论
• 4.1 牛传染性鼻气管炎病毒gG基因缺失突变株的构建
• 4.2 抗牛传染性鼻气管炎病毒gG蛋白单克隆抗体的制备
• 4.2.1 McAb的效价
• 4.2.2 动物的免疫
• 4.2.3 细胞融合
• 4.2.4 筛选
• 4.2.5 克隆
• 第5章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢