慢病毒载体介导人IL-12基因修饰树突状细胞体外抗肺癌作用的研究

论文摘要

本研究以肺癌为DCs疫苗治疗的靶细胞,利用慢病毒载体介导人IL-12基因修饰DCs,利用化疗药物作用的肺癌细胞冲击基因修饰的DCs,使DCs负载肺癌细胞的全部抗原信息。通过观察慢病毒载体介导人IL-12基因的DCs转移效率、IL-12基因在DCs内表达,以及DCs成熟与诱发的针对肺癌细胞的细胞毒作用等几个方面来对慢病毒载体介导的人IL-12基因修饰的DCs疫苗体外抗肺癌的效果进行评价,从而为抗肿瘤的基因修饰的DCs疫苗制备提供新的方法。经过实验研究取得如下研究成果:1成功构建了人IL-12慢病毒载体,该病毒载体被包装后,可有效整合到293FT细胞基因组中并成功表达人IL-12蛋白。2携带人IL-12基因的慢病毒成功进行了DCs细胞的感染,并有较高的感染效率,IL-12基因在DCs内的表达,提高了其刺激淋巴细胞增殖的能力,并促进了DCs表面分子CD83的上调。3应用化疗药物作用的肺癌A549细胞全抗原负载人IL-12基因修饰DCs可诱发高效抗肿瘤免疫反应。

论文目录

• 提要
• 英文缩写词表
• 文献综述
• 1 DCs 来源与功能
• 2 DCs 免疫活性的调控
• 3 DCs 的体外培养
• 4 DCs 负载抗原的种类及方法
• 5 抗原的量、抗原递呈持续时间及负载的时机
• 6 基因修饰DCs 疫苗
• 7 DCs 疫苗的临床实验
• 8 小结
• 前言
• 第1章 IL-12 基因慢病毒载体构建及其表达
• 1.1 主要材料与仪器
• 1.1.1 细胞系、菌株、质粒
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 人IL-12 基因克隆
• 1.2.2 pWPXLd-IL-12 载体的构建
• 1.2.3 慢病毒载体包装
• 1.2.4 包装病毒感染293FT 细胞
• 1.2.5 重组IL-12 在细胞基因组DNA 的PCR 鉴定
• 1.2.6 eGFP 在293FT 细胞的表达
• 1.2.7 重组IL-12 在293FT 细胞的表达
• 1.2.8 统计学处理
• 1.3 实验结果
• 1.3.1 构建的IL-12 慢病毒载体质粒图谱
• 1.3.2 人IL-12 基因克隆PCR 结果
• 1.3.3 pMD18-IL-12-MS 质粒酶切鉴定
• 1.3.4 pWPXLd-IL-12 质粒载体酶切鉴定结果
• 1.3.5 IL-12 整合到慢病毒感染293FT 细胞基因组检测结果
• 1.3.6 eGFP 在293FT 细胞表达检测结果
• 1.3.7 RT-PCR 检测LV-12 感染293FT 细胞hIL-12 的表达结果
• 1.3.8 ELISA 检测 IL-12 的结果
• 1.4 讨论
• 1.4.1 慢病毒载体的构建
• 1.4.2 慢病毒颗粒产生以及滴度测定
• 第2章 IL-12 基因慢病毒载体感染DCS研究
• 2.1 主要材料与仪器
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 DCs 的培养与病毒颗粒感染
• 2.2.2 DCs 培养上清IL-12 含量测定
• 2.2.3 DCs 表面分子CD83 的流式检测
• 2.2.4 DCs 刺激淋巴细胞增殖实验
• 2.2.5 流式细胞术测定 GFP 在 DCs 内表达
• 2.2.6 PCR 方法检测IL-12 基因的DCs 基因组的整合
• 2.2.7 统计学处理
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 DCs 诱导的结果
• 2.3.2 流式细胞术检测GFP 基因在DCs 表达
• 2.3.3 LV-12 感染DCs 后基因组内IL-12 基因检测结果
• 2.3.4 ELISA 测定DCs 分泌IL-12 实验结果
• 2.3.5 DCs 表面分子CD83 的流式检测结果
• 2.3.6 DCs 刺激淋巴细胞增殖结果
• 2.4 讨论
• 第3章 化疗药物作用的肺癌A549 细胞冲击IL-12 基因慢病毒载体转染DCS体外杀伤肺癌细胞作用的研究
• 3.1 实验材料与仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 化疗药物作用的肺癌A549 细胞制备
• 3.2.2 化疗药物作用的肺癌A549 细胞全抗原负载DCs
• 3.2.3 DCs 表型的测定
• 3.2.4 致敏DCs 诱导的淋巴细胞增殖反应
• 3.2.5 致敏DCs 诱导的CTL 活性的检测
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 化疗药物作用的A549 死亡细胞形态学变化
• 3.3.2 化疗药物作用的A549 死亡细胞DNA 变化
• 3.3.3 化疗药物作用的A549 细胞负载DCs 后CD83 检测结果
• 3.3.4 致敏DCs 诱导的淋巴细胞增殖
• 3.3.5 致敏DCs 诱导的CTL 活性
• 3.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 攻读博士期间发表论文
• 致谢
• 中文摘要
• ABSTRACT