河南省猪源隐孢子虫种类鉴定及其分子种系发育关系研究

论文摘要

本研究对河南省部分地市规模化猪场猪寄生虫病进行了流行病学调查,并对猪隐孢子虫分离株进行初步形态学鉴定、巢式PCR检测和PCR-RFLP分析;基于核糖体小亚基（18S rDNA）基因的种系发育分析研究鉴定河南省猪源隐孢子虫分离株种类、基因型,确定猪源隐孢子虫分离株和其它种类隐孢子虫之间的分子种系进化关系,为预防隐孢子虫病提供理论基础。应用直接涂片法、饱和食盐溶液漂浮法、水洗沉淀法、饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法等5种方法,对河南省10个地市14个规模化猪场不同年龄猪群的1429份粪便样品（310为淤泥）进行检查,结果显示:猪肠道寄生虫感染主要为球虫、线虫、蛔虫、结肠小袋纤毛虫和隐孢子虫;寄生虫总感染率为56.21%,其中球虫总感染率为41.73%;类圆线虫总感染率为5.45%;蛔虫感染率11.53%;结肠小袋纤毛虫感染率为9.47%;鞭虫感染率为6.43%。127份样品中查到隐孢子虫卵囊;0～1月龄、1～2月龄、2～6月龄、6月龄以上猪和成年公猪的感染率分别为:14.0%、23.4%、12.1%、9.8%、8.8%;所检查的淤泥中未检测出隐孢子虫;猪的隐孢子虫感染存在年龄和地区性差异,而且可能与环境、地理位置有关,所检出的隐孢子虫卵囊经形态学观察,初步鉴定为猪隐孢子虫（Cryptosporidium suis）。8个隐孢子虫阳性猪场分离到的卵囊大小和形态结构基本一致,卵囊平均大小为5.000μm×4.583μm,卵囊形状指数平均为1.09,初步定为猪隐孢子虫（C. suis）。其结果为今后有效防治猪寄生虫病提供科学依据。本试验利用巢式PCR扩增9个隐孢子虫分离株18S rRNA基因部分片段,PCR产物经连接转化,挑选阳性克隆进行测序,产物序列长度均为840bp;用限制性内切酶SspI和VspI对PCR产物进行消化酶切确定种类和基因型。SspI酶切结果:9个隐孢子虫分离株酶切后产生454bp、378bp两个片段;VspI酶切结果:9个隐孢子虫分离株酶切后产生633 bp、115bp两个片段,根据酶切片段初步确定这9个隐孢子虫分离株为猪隐孢子虫（C.suis）,未发现猪隐孢子虫基因型Ⅱ。为从种系发育关系确定河南省猪源隐孢子分离株的种类或基因型,利用巢式PCR对9个隐孢子虫分离株进行18S rDNA基因特定片段扩增,并对扩增片段进行测序,测序后的序列用Blast或Fasta在NCBI、EMBL和DDBJ三大核酸序列数据库搜索同源序列,然后利用Clustal X1.81、Phylip3.64和DNAstar4.0等生物学软件对序列进行比对、构建分子进化树以及同源性分析。根据在18S rRNA基因位点种系进化关系分析,表明9个猪源隐孢子虫分离株为猪隐孢子虫C. suis。PCR-RFLP和18SrRNA基因序列分析均证明了河南猪源隐孢子虫分离株为C.suis。C.suis流行很广泛,世界各地的分离株基因序列同源性很高,说明了猪隐孢子虫感染是非常普遍的,不受地域条件的限制。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• 文献综述
• 1 引言
• 2 分类
• 3 猪隐孢子虫流行病学特点
• 4 隐孢子虫基因组特征
• 5 治疗
• 6 预防
• 7 结语
• 实验部分
• 第一部分 河南省规模化猪场猪肠道寄生虫感染情况调查
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 3 结果与分析
• 4 结论与讨论
• 第二部分 河南省规模化猪场猪隐孢子虫病流行病学调查
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 3 结果与分析
• 4 结论与讨论
• 第三部分 河南省猪源隐孢子分离株巢氏 PCR-RFLP 鉴定
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 3 结果与分析
• 4 结论与讨论
• 第四部分 基于18Sr RNA基因的猪源隐孢子虫种系发育关系研究
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 3 结果与分析
• 4 结论与讨论
• 参考文献
• 英文摘要