运用酵母双杂交技术筛选帕金森病相关基因LRRK2相互作用蛋白

论文摘要

帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种在中枢神经系统发生慢性和渐进性神经变性病变的疾病,其会损坏机体对随意运动的控制,临床症状为运动徐缓、肌肉强直、静止震颤以及运动失衡等运动系统障碍。PD的病理学特征为黑质致密部多巴胺能神经元缺失,以及在剩余的多巴胺能神经元中出现泛素阳性的Lewy body。虽然帕金森病主要是散发的。但是5%-15%与遗传相关。迄今,α-synuclein、Parkin、UCH-L1、PINK1、DJ-1、LRRK2、ATP13A2、HtrA2这8个基因是已经确定的与遗传性帕金森病相关的基因。LRRK2基因有51个外显子,编码的蛋白多达2527个氨基酸,包含ANK、LRR、ROC、COR、Kinase和WD40等多个结构域。已经发现的PD相关突变在LRRK2的各个结构域中均有分布,尤以位于Kinase结构域的G2019S最为常见。LRRK2的分子量大约280KD,在脑和其它器官以及细胞系HEK293T中均可表达,功能尚不清楚。已有的研究表明,LRRK2的R1441C、G2019S、I2020T等PD相关突变导致LRRK2激酶活性上升,细胞生活力下降,说明这些突变对细胞是有毒性的。而且LRRK2参与调节神经元突起的形态建成,并在突触囊泡蛋白的极性分布中起重要的作用。LRRK2基因突变引起大部分的家族性和一些散发性帕金森病。选用全长的COR功能域和一部分MAPKKK与ROC功能域作为诱饵,用酵母双杂交系统筛选人胎脑cDNA文库中能与该诱饵相互作用的蛋白。诱饵片段由聚合酶链式反应（PCR）扩增后连入酵母表达质粒pGBKT7,pGBKT7-Bait质粒经测序验证后转化酵母菌株AH109,用免疫印记（Western Boltting）来检验该质粒在酵母中的表达,人类胎脑cDNA文库被转化到能稳定表达诱饵蛋白的酵母菌株中,并铺到含有X-α-gal的四缺（SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade）的培养皿上。随后,我们使用分别含有pGBKT7和pGBKT7-Bait的AH109酵母菌株进行回交检测,进一步确证从初步筛选中获得的阳性克隆。最后用生物信息学来分析这些经再次确证的阳性克隆中的文库质粒。最终获得了9个真阳性的克隆,经生物信息学分析其中有3个克隆中的序列不在已知基因的开放阅读框内。其余6个克隆中的序列在以下几个已知基因的开放阅读框中:STRBP、BAG5、PTPN23、L3MBTL3、RALYL、KIAA1783。经酵母双杂交后成功地获得了真阳性克隆。相信这些相互作用蛋白将为研究LRRK2的功能、帕金森病发病机理和其他神经性疾病提供一些新的线索。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 英文缩略词表
• 前言
• 构建诱饵质粒及酵母双杂交筛选
• 1 材料与试剂
• 2 实验方法
• 3 结果
• 4 分析讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 攻读硕士学位期间主要研究成果