发光杆菌诱变方法和发酵液抑菌活性的研究

论文摘要

发光杆菌是与异小杆线虫共生的肠杆菌科细菌，它存在于昆虫病原线虫肠道内，可随线虫的侵染进入寄主昆虫血腔，迅速繁殖并产生多种代谢产物，抑制其它杂菌的污染，从而保护线虫繁殖的环境。本文对发光杆菌（Photorhabdus luminescens1029）抑菌活性进行了初步的研究，并探讨发光杆菌高毒力菌株的选育方法。结果如下：1．Photorhabdus luminescens 1029发酵液对供试的10种植物病原菌和枯草杆菌均具抑制作用，对真菌病害中的芒果拟茎点霉病菌和荔枝霜疫霉病菌抑制作用较强，EC50分别为100倍和50倍稀释液；对细菌中的马铃薯环腐病菌、枯草芽孢杆菌和烟草青枯病菌的抑菌作用较强，中浓度对应的抑菌圈直径φ中达到了15.08mm、9.64mm和8.10mm。表明Photorhabdus luminescens 1029发酵液具有广谱抑菌活性。2．用烟草青枯病菌作指示菌，探讨了发酵时间、温度、pH、紫外线和太阳光等环境因子对发酵液抑菌活性的影响。结果表明，pH7～9时发酵液抑菌作用最强；发酵液组分较复杂，既有耐高温的组分也有对其敏感的组分：用紫外线照射在短时间内表现出抑制作用，而随着时间的延长，会使发酵液抑菌活性增强，而太阳光对抑菌组分则表现出破坏作用；在发酵24～144h期间，于72h～84h时发酵液具最强的抑制活性。3．发酵液用乙酸乙酯萃取，取油相，30～40℃减压旋转蒸发至干，制得含抑菌组分的粗提物。将粗提物用100～200目的硅胶层析分离，得到4个组分，将活性组分进行MS和1HNMR分析推测其化学本质是2-isopropyl-5-（2-phenylethenyl）-benzene-1，3-diol，与Richardson等从Photorhabdus luminescens HK中分离出的抑菌成分相同，属于羟化二苯乙烯衍生物。4．用烷化剂1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍（NTG）作诱变剂，将其直接加到肉汤培养基中，控制浓度为10μg／ml,并加几滴吐温-80，使之乳化，在28℃、170r／min条件下培养24h完成突变。采用琼脂块高通量法初筛，摇瓶复筛，得到毒力效价提高12.82％的突变菌株，经过遗传稳定性检验，能够稳定遗传。

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Abstract

缩略语表

1 前言

1.1 微生物农药在植物病虫害中的应用

1.1.1 生物农药的概念

1.1.2 生物农药的特点

1.1.3 微生物农药的研究与应用现状

1.1.4 微生物农药的发展前景与存在的问题

1.2 发光杆菌（Photorkabdus luminescens）的研究进展

1.2.1 分类地位和培养特征

1.2.2 抑菌物质与杀虫蛋白

1.2.3 发光杆菌的分子生物学

1.2.4 开发应用与展望

1.3 本项研究的目的、意义及研究思路

2 材料与方法

2.1 供试材料

2.1.1 菌株

2.1.2 病原菌

2.1.3 培养基

2.1.4 主要试剂

2.1.5 主要仪器

2.2 菌种培养

2.2.1 菌种活化

2.2.2 菌悬液的制备

2.2.3 摇瓶发酵培养

2.3 抑菌谱测定

2.3.1 发酵液的效价测定

2.3.2 计算方法

2.3.3 数据分析

2.4 环境因子对抑菌活性的影响

2.4.1 指示菌菌悬液的配制

2.4.2 不同环境因子的处理方法

2.4.3 计算方法

2.4.4 数据分析

2.5 发酵液活性成分的分离纯化与结构鉴定

2.5.1 发酵液粗提物的制备

2.5.2 发酵液粗提物的硅胶柱层析分离

2.5.3 活性成分的结构鉴定

2.6 诱变选育方法确定

2.6.1 诱变方法

2.6.2 筛选方法

2.6.3 计算方法

2.6.4 数据分析

3 结果与分析

3.1 抑菌谱的测定结果

3.2 环境因子对发酵液抑菌活性的影响

3.2.1 温度对发酵液抑菌活性的影响

3.2.2 pH值对发酵液活性的影响

3.2.3 紫外线对发酵液活性的影响

3.2.4 太阳光对发酵液活性的影响

3.2.5 发酵时间对发酵液抑菌活性的影响

3.3 发酵液活性成分的分离纯化与结构鉴定

3.3.1 活性成分的硅胶柱层析分离及活性跟踪

3.3.2 活性成分结构鉴定

3.4 诱变选育方法

3.4.1 初筛结果

3.4.2 复筛结果

3.4.3 菌株的遗传稳定性试验

4 结论与讨论

4.1 结论

4.2 讨论

4.2.1 开发微生物农药

4.2.2 诱变方法

4.2.3 在医药和饲料中的运用

4.3 本文的创新点

参考文献

致谢

附录

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