淮南猪IL-2基因的克隆及在大肠杆菌和昆虫细胞中的表达

论文摘要

白细胞介素2（Interleukin-2, IL-2）主要是由激活的T淋巴细胞产生的一类细胞因子,在机体免疫应答中起重要作用。其最重要的功能是诱导T淋巴细胞增殖（从G0期到S期）和分化,并且具有刺激T辅助细胞和自然杀伤细胞分泌细胞因子等功能。本研究以猪IL-2为研究对象,首次克隆出了淮南猪IL-2全基因,然后分别亚克隆到原核与真核表达载体中,并对其生物学活性进行了初步研究。主要内容包括:1.参照GenBank发表的猪IL-2 cDNA基因序列,设计1对引物,将淮南猪脾淋巴细胞在伴刀豆球蛋白A （ConA）的刺激下体外培养27 h后,提取激活淋巴细胞总RNA,进行反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增,然后克隆到pGEM-T Easy载体上并测序。测序结果显示,克隆的淮南猪IL-2 cDNA全长为516个碱基,开放阅读框（ORF）包含465个碱基,编码154个氨基酸,分子量为17.4 KDa,等电点为5.47,疏水氨基酸34%,亲水氨基酸34%,碱性氨基酸11%,酸性氨基酸23%。此cDNA与已报道的猪IL-2同源性为100%,与猫、牛、鸡、狗、鸭、山羊、马、人、家鼠等的IL-2基因进行比较分析,核苷酸同源性分别为83.7%,82.6%,28.2%,80.6 %,29.6%,83.4%,81.3%,82.0%,61.5%。2.为了在大肠杆菌中表达淮南猪IL-2基因,并鉴定其生物学活性,设计1对引物,将编码淮南猪IL-2的成熟蛋白基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,获得重组质粒pGEX-IL2,进而转化BL21感受态细胞中;经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE检测淮南猪IL-2基因的表达情况,运用Western-blot和MTT法对表达蛋白进行特异性检测和活性测定。结果表明,淮南猪IL-2基因在大肠杆菌中得到高效表达,其表达蛋白具有特异性和生物学活性。3.为了在杆状病毒表达载体中表达猪IL-2基因,并鉴定其生物学活性,设计1对引物,将编码猪IL-2的成熟蛋白基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDual中,获得重组质粒pFBD-IL2,进而转化含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,发生转座作用;经抗性及蓝白斑筛选得到含猪IL-2基因的重组质粒rBacmid-IL2。然后将重组质粒转染昆虫细胞,间接免疫荧光表明猪IL-2在Sf-9昆虫细胞中获得了表达,SDS-PAGE可检测到分子质量为20 KDa的重组蛋白,Western blot证实该重组蛋白可与兔抗猪IL-2单克隆抗体发生特异性反应,表达产物经纯化后能明显促进猪T淋巴细胞转化。结果表明,猪IL-2基因在昆虫细胞中得到正确表达,其表达蛋白具有生物学活性。综上所述,本研究成功克隆出了河南优良地方品种淮南猪IL-2全基因,并分别在大肠杆菌表达系统和昆虫杆状病毒表达系统中进行了表达,对其表达产物进行了生物学活性测定,为进一步研究猪IL-2功能性蛋白作为分子佐剂在疫苗免疫中的促进作用及开发研制新型免疫增强剂定了基础。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 文献综述
• 1 白细胞介素-2 的研究概况
• 1.1 IL-2 的发现
• 1.2 IL-2 的产生
• 1.3 IL-2 的分子结构
• 1.4 IL-2 的受体及其特性
• 1.5 IL-2 的克隆与体外重组
• 1.6 IL-2 的生物学活性
• 1.6.1 诱导T 淋巴细胞的增殖与分化
• 1.6.2 诱导NK、LAK 细胞增殖
• 1.6.3 对B 细胞和巨噬细胞的作用
• 1.7 IL-2 的应用
• 1.7.1 作为免疫治疗剂
• 1.7.2 作为免疫增强剂
• 1.7.3 构建新型重组基因工程疫苗
• 1.7.4 作为临床诊断指标
• 2 杆状病毒表达系统的研究概况
• 2.1 杆状病毒的分类
• 2.2 杆状病毒的结构
• 2.3 杆状病毒表达系统的基本原理
• 2.4 杆状病毒转移载体的种类及启动子
• 2.4.1 非融合型和融合型转移载体
• 2.4.2 单元和多元表达载体
• 2.4.3 转移载体的启动子
• 2.5 杆状病毒表达系统的构建策略
• 2.5.1 NPV DNA 线性化技术
• 2.5.2 绿色荧光蛋白反向筛选标记系统
• 2.5.3 酵母-昆虫细胞穿梭载体筛选体系
• 2.5.4 大肠杆菌E.coli-昆虫细胞的穿梭载体筛选系统
• 2.5.5 杆状病毒-S2 系统
• 2.5.6 其他重组方法
• 2.6 杆状病毒表达系统的优越性
• 2.6.1 高效表达外源基因
• 2.6.2 可容纳较大的外源DNA 片段
• 2.6.3 表达产物后加工完善，活性高
• 2.6.4 安全性好
• 2.6.5 适合表达细胞毒性蛋白
• 2.6.6 阳性克隆筛选方便
• 2.7 影响外源基因表达水平的因素
• 2.7.1 宿主因素
• 2.7.2 外源基因及其编码产物的特性
• 2.7.3 启动子类型
• 2.7.4 启动子序列完整性
• 2.7.5 其他因素
• 2.8 杆状病毒表达系统的应用前景
• 引言
• 试验一 淮南猪IL-2 全基因的克隆与遗传进化分析
• 1 材料和方法
• 1.1 供试材料
• 1.1.1 试验动物
• 1.1.2 菌种和质粒
• 1.1.3 基因克隆相关试剂
• 1.1.4 试剂盒
• 1.1.5 主要仪器
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 引物设计与合成
• 1.2.2 淮南猪脾淋巴细胞总RNA 的提取
• 1.2.3 淮南猪IL-2 全基因的RT-PCR 扩增
• 1.2.4 PCR 产物的回收纯化
• 1.2.5 PCR 产物的连接
• 1.2.6 连接产物的转化
• 1.2.7 挑斑
• 1.2.8 质粒提取
• 1.2.9 克隆鉴定
• 2 结果
• 2.1 淮南猪IL-2 全基因的RT-PCR 扩增
• 2.2 淮南猪IL-2 基因的克隆及鉴定
• 2.3 淮南猪IL-2 基因序列测定及分析
• 2.4 淮南猪IL-2基因与其他猪品种及不同动物的IL-2基因核苷酸序列同源性比较及系统进化分析
• 3 结论与讨论
• 3.1 关于淋巴细胞的提取及诱导培养
• 3.2 关于pIL-2 的RT-PCR 扩增
• 3.3 关于pIL-2 基因的序列分析
• 试验二 淮南猪IL-2 基因在大肠杆菌中的表达及生物学活性测定
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.1.1 菌种和质粒
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 试剂盒
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 目的片段的制备
• 1.2.1.1 引物设计
• 1.2.1.2 pIL-2 成熟蛋白基因的PCR 扩增与纯化回收
• 1.2.1.3 目的片段的酶切回收
• 1.2.2 重组表达载体的构建
• 1.2.2.1 表达载体的纯化与扩增
• 1.2.2.2 表达载体的质粒提取
• 1.2.2.3 表达质粒的酶切回收
• 1.2.2.4 目的片段与表达质粒的连接
• 1.2.3 重组质粒的转化和筛选
• 1.2.4 重组表达质粒的鉴定
• 1.2.4.1 重组表达质粒的提取
• 1.2.4.2 重组表达质粒的PCR 鉴定
• 1.2.4.3 重组表达质粒的酶切鉴定
• 1.2.4.4 重组表达质粒的序列测定
• 1.2.5 重组表达质粒的诱导表达
• 1.2.6 重组表达蛋白的SDS-PAGE 电泳
• 1.2.7 重组表达蛋白的Western blot 分析
• 1.2.8 表达蛋白的纯化与复性
• 1.2.9 表达蛋白的生物学活性测定
• 2 结果
• 2.1 淮南猪IL-2 成熟蛋白基因的扩增
• 2.2 重组表达载体的构建
• 2.3 重组表达载体的鉴定
• 2.4 表达蛋白的SDS-PAGE 检测
• 2.5 表达蛋白的Western blot 分析
• 2.6 表达蛋白的纯化及复性
• 2.7 表达蛋白的生物学活性测定
• 3 结论与讨论
• 3.1 关于原核表达载体的选择
• 3.2 关于表达条件的优化
• 3.3 关于表达蛋白的纯化与复性
• 3.4 关于重组pIL-2 生物学活性的测定
• 试验三 淮南猪IL-2 基因在昆虫细胞中的表达及生物学活性测定
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.1.1 菌种和质粒
• 1.1.2 细胞与培养基
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 试剂盒
• 1.1.5 主要仪器
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 目的片段的制备
• 1.2.1.1 引物设计
• 1.2.1.2 pIL-2 成熟蛋白基因的PCR 扩增与纯化回收
• 1.2.1.3 目的片段的酶切回收
• 1.2.2 重组转座载体的构建
• 1.2.2.1 转座载体的纯化与扩增
• 1.2.2.2 转座载体的质粒提取
• 1.2.2.3 转座载体质粒的酶切回收
• 1.2.2.4 目的片段与转座载体质粒的连接
• 1.2.2.5 重组质粒的转化和筛选
• 1.2.3 重组转座载体的鉴定
• 1.2.3.1 重组转座载体质粒的提取
• 1.2.3.2 重组转座载体质粒的PCR 鉴定
• 1.2.3.3 重组转座载体质粒的酶切鉴定
• 1.2.3.4 重组转座载体质粒的序列测定
• 1.2.4 重组穿梭载体的构建
• 1.2.4.1 DH10Bac 感受态细胞的制备
• 1.2.4.2 位点特异性转座
• 1.2.5 重组穿梭载体的鉴定
• 1.2.5.1 重组穿梭载体阳性克隆的筛选
• 1.2.5.2 重组穿梭载体质粒的提取
• 1.2.5.3 重组穿梭载体的PCR 鉴定
• 1.2.6 重组杆状病毒的获得及鉴定
• 1.2.6.1 转染Sf9 昆虫细胞获得P1 代病毒
• 1.2.6.2 P2 代及P3 代重组病毒的扩增
• 1.2.6.3 重组杆状病毒DNA 的提取与PCR 鉴定
• 1.2.7 间接免疫荧光检测猪IL-2 基因的表达
• 1.2.8 重组表达蛋白的SDS-PAGE 电泳
• 1.2.9 重组表达蛋白的Western blot 分析
• 1.2.10 表达蛋白的纯化
• 1.2.10.1 样品的处理
• 1.2.10.2 过柱纯化
• 1.2.11 表达蛋白的生物学活性测定
• 2 结果
• 2.1 淮南猪IL-2 成熟蛋白基因的扩增
• 2.2 重组转座载体的鉴定
• 2.3 重组穿梭载体的鉴定
• 2.4 转染后细胞形态学变化与PCR 检测
• 2.5 表达产物的间接免疫荧光检测
• 2.6 表达蛋白的SDS-PAGE 和Western-blot 检测
• 2.7 表达蛋白的纯化
• 2.8 表达蛋白的生物学活性测定
• 3 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 英文摘要
• 硕士期间主要发表论文